Evolución del área superficial y módulo de cizallamiento de la membrana de glóbulos rojos humanos maduros durante la fatiga mecánica

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 8563 (2023) Citar este artículo

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Las propiedades mecánicas de los glóbulos rojos (RBC) cambian durante su senescencia, lo que respalda numerosos procesos fisiológicos o patológicos en los sistemas circulatorios al proporcionar entornos mecánicos celulares cruciales para la hemodinámica. Sin embargo, faltan en gran medida estudios cuantitativos sobre el envejecimiento y las variaciones de las propiedades de los glóbulos rojos. En este documento, investigamos los cambios morfológicos, el ablandamiento o la rigidez de los glóbulos rojos individuales durante el envejecimiento utilizando un modelo de fatiga mecánica in vitro. Usando un sistema de microfluidos con microtubos, los glóbulos rojos se someten repetidamente a estiramiento y relajación a medida que entran y salen de una región de contracción repentina. Los parámetros geométricos y las propiedades mecánicas de los glóbulos rojos humanos sanos se caracterizan sistemáticamente en cada ciclo de carga mecánica. Nuestros resultados experimentales identifican tres transformaciones de forma típicas de los glóbulos rojos durante la fatiga mecánica, que están fuertemente asociadas con la pérdida de área superficial. Construimos modelos matemáticos para la evolución del área superficial y el módulo de corte de la membrana de glóbulos rojos individuales durante la fatiga mecánica, y desarrollamos cuantitativamente un parámetro de conjunto para evaluar el estado de envejecimiento de los glóbulos rojos. Este estudio proporciona no solo un nuevo modelo de fatiga in vitro para investigar el comportamiento mecánico de los glóbulos rojos, sino también un índice estrechamente relacionado con la edad y las propiedades físicas inherentes para una diferenciación cuantitativa de glóbulos rojos individuales.

En los mamíferos, los glóbulos rojos (GR) se encuentran entre las células más importantes para mantener las condiciones de vida mientras viajan continuamente a través de varios tamaños de vasos circulatorios y espacios estrechos. Durante la vida útil típica de 120 días de un glóbulo rojo humano, cambia las propiedades geométricas y mecánicas con el envejecimiento celular1,2,3 y exhibe fenotipos biofísicos para el diagnóstico de diversas enfermedades4,5. A diferencia de la senescencia de las células nucleadas, los glóbulos rojos no tienen núcleo y, por lo tanto, exhiben una regulación única para el envejecimiento celular. A medida que los glóbulos rojos se escurren repetidamente a través de la microvasculatura y las hendiduras interendoteliales (IES) esplénicas submicrónicas, y atraviesan la macrovasculatura, experimentan ciclos mecánicos significativos a través de un gran estiramiento elástico y relajación6. Entre una de las preguntas más importantes para la biología de los glóbulos rojos, el efecto de la fatiga mecánica en la senescencia de los glóbulos rojos no se ha abordado cuantitativamente.

Durante el envejecimiento celular, los glóbulos rojos se desprenden parcialmente de sus membranas, lo que lleva a un cambio en su morfología de una forma de copa a una estable discoide bicóncava7. Los glóbulos rojos mantienen sus formas celulares óptimas durante circulaciones a largo plazo mediante la generación de microvesículas8,9 y la regulación del volumen celular10 para eliminar el daño celular, incluido el daño de la membrana debido a la fatiga mecánica y el estrés oxidativo3. El análisis de las características físicas que comparan los glóbulos rojos jóvenes con los envejecidos1,2,11 emplea el marcaje de isótopos, biotina o hemoglobina glucosilada (HbA1c) como marcadores de la edad celular11,12 y respalda que el volumen y el área superficial disminuyen monótonamente con el envejecimiento celular. Pero las observaciones sobre el cambio del módulo de cizallamiento de la membrana durante el envejecimiento celular no son consistentes, ya que Sutera et al.13 observaron un aumento significativo en el módulo elástico de la membrana de los glóbulos rojos durante el envejecimiento celular in vivo, mientras que Li et al.14 afirmaron que los reticulocitos son más rígidos. que los eritrocitos maduros.

Debido a la falta de un núcleo y ARNm, los glóbulos rojos responden principalmente a su microambiente mecánico de forma pasiva, por lo tanto, podría decirse que la sujeción de los glóbulos rojos a estímulos mecánicos durante su vida útil es importante. Se ha notado que la carga mecánica en el bazo juega un papel crucial en la biología de los glóbulos rojos. La estructura IES específica del bazo no solo facilita la maduración a través de la eliminación de orgánulos de reticulocitos15, sino que también contribuye a la alteración del módulo de cizallamiento de la membrana, la transición de forma5,7,15 y la eliminación de glóbulos rojos envejecidos o enfermos15,16,17. Aquí, los flujos esplénicos con glóbulos rojos que atraviesan un IES de típicamente 0,65 μm de longitud y 2–3 μm de altura son características cruciales de su formación de vesículas, ya que la densidad de las conexiones del esqueleto a la membrana es vulnerable a la reducción bajo ciclos mecánicos con rendijas extremadamente estrechas18. Esto está respaldado por el descubrimiento de que aparece una mayor pérdida de hemoglobina en vesículas de glóbulos rojos de individuos con trastornos esplénicos en comparación con las de individuos sanos in vivo19. Además, en trastornos sanguíneos como la esferocitosis hereditaria, la tasa de pérdida de área de superficie en los glóbulos rojos aumenta bajo la carga cíclica esplénica debido al debilitamiento de la cohesión entre la bicapa lipídica y el citoesqueleto17. Por lo tanto, el ciclo mecánico a través de vasos microcapilares y lúmenes estrechos como rutina estándar de estimulación mecánica en la vida útil de los glóbulos rojos implica un principio mecánico subyacente para su maduración y envejecimiento. Por lo tanto, se necesita más investigación para comprender la evolución cuantitativa del área superficial y el módulo de cizallamiento de la membrana de glóbulos rojos individuales con ciclos mecánicos, en relación con el proceso de envejecimiento de los glóbulos rojos.

Estudios recientes sobre los cambios en las propiedades mecánicas de los glóbulos rojos adoptaron el ciclo mecánico como cargas típicas para acelerar el envejecimiento celular in vitro, y se probaron varios modelos de este tipo. Un modelo simple usó microcanales rectangulares con una sección transversal de \(3\times 4\) μm2, donde la reducción de la deformabilidad de glóbulos rojos individuales se estimó aproximadamente usando el parámetro de Taylor20. Se establecieron canales que imitan IES fabricados con tecnologías de microfluidos para glóbulos rojos circulantes, y se evaluaron las variaciones en los perfiles de glóbulos rojos y su deformabilidad21. La electrodeformación modulada en amplitud también se usó para la estimulación mecánica repetida de los glóbulos rojos para estudiar su fatiga mecánica bajo hipoxia y agotamiento de ATP22,23,24. Para caracterizar las características geométricas de las células (como su tamaño, área de superficie y volumen) con precisión y por separado de sus propiedades mecánicas (como el módulo de corte de la membrana) durante el proceso de ciclos mecánicos, se deben establecer modelos más adecuados.

Para medir las variaciones de las características geométricas y la rigidez de la membrana de los glóbulos rojos individuales durante su ciclo mecánico, proponemos un método de microfluidos para simular el ciclo mecánico de los glóbulos rojos individuales. Se conectó un microtubo con un diámetro interior redondo de 3 μm a un sistema hidráulico con control de presión reversible. Los glóbulos rojos entran y salen de las contracciones repentinas de un reservorio a través del microtubo, donde los glóbulos rojos experimentaron condiciones de fatiga por restricción similares a las de una hendidura esplénica. Las características morfológicas (glóbulos rojos en forma de copa y bicóncavos principalmente), los parámetros geométricos (área de superficie, volumen) y las propiedades mecánicas (módulo de corte de la membrana) de los glóbulos rojos humanos sanos se miden con precisión y se registran instantáneamente con cada ciclo mecánico de la célula. Con el presente método, observamos la pérdida de área durante el ciclismo e identificamos claramente tres transiciones de forma típicas de los glóbulos rojos bajo fatiga. Hemos desarrollado modelos matemáticos para estudiar la evolución del área de superficie y el módulo de corte de glóbulos rojos individuales durante el ciclo mecánico. Estos modelos proporcionan información sobre los mecanismos subyacentes al proceso de envejecimiento de los glóbulos rojos, caracterizado por la pérdida de superficie y las variaciones de rigidez. Además, hemos definido un parámetro de conjunto como un marcador biofísico novedoso para evaluar el estado de salud de los glóbulos rojos individuales a nivel celular. Este parámetro tiene el potencial de ser utilizado en la práctica clínica para el diagnóstico de enfermedades relacionadas con los glóbulos rojos.

Desarrollamos un modelo de ciclo mecánico de RBC único in vitro (Fig. 1a). A diferencia de los modelos anteriores que utilizan microfluidos, que consisten en un canal convergente-divergente con una región de transición suave en las secciones transversales20, o emplean una carga de tracción cíclica en un glóbulo rojo adherente con campos eléctricos de electrodo modulado en amplitud22, un canal tubular con alrededor de 3,0 –3,2 µm de diámetro se sumerge en una cámara grande con una suspensión de glóbulos rojos. Las presiones impulsoras de los flujos en el canal se pueden cambiar entre dos presiones hidrostáticas diferentes que son más altas o más bajas que la presión dentro de la cámara al conectar el canal tubular con dos columnas de líquido a diferentes alturas a través de una válvula eléctrica de tres vías (Fig. 1a ). Al controlar la presión en el canal con un programa compilado, los glóbulos rojos individuales experimentan una contracción repentina seguida de expansión y relajación (Fig. 1b) repetidamente mientras son aspirados o expulsados del microcanal con flujos de fluido bajo presiones hidráulicas. Con este modelo de ciclo mecánico in vitro para glóbulos rojos individuales, no solo pudimos imitar el proceso de fatiga mecánica más severo de los glóbulos rojos in vivo, sino también medir las variaciones en el área superficial, el volumen y el módulo de corte de la membrana de cada glóbulo rojo durante cada ronda de ciclismo.

Modelo de ciclos mecánicos in vitro de glóbulos rojos únicos utilizando canales microtubulares. (a) Configuración experimental. Un canal tubular sumergido en una gran cámara está conectado a dos fuentes de presión hidrostática diferentes a través de una válvula eléctrica. Las imágenes de las células se adquieren y graban con una cámara CMOS montada en el microscopio. El sistema experimental está controlado por un programa informático. La región de interés para la medición dinámica es la región en constante movimiento de la celda deformada. (b) Imágenes secuenciales de un RBC comprimiéndose y siendo expulsado de un microtubo bajo una contracción y expansión repentinas. La parte superior representa el proceso de aspiración y la parte inferior es la descarga y relajación de glóbulos rojos. La barra de escala es de 10 μm. ( c ) RBC simulado que entra y sale del microcanal con un diámetro interno de 3 μm. Los colores denotan los contornos de la densidad de fuerza de la membrana en la membrana deformada durante el ciclo mecánico. ( d ) Distribuciones de la densidad de fuerza de la membrana a lo largo de la membrana deformada durante el ciclo mecánico.

El diámetro del canal tubular está optimizado para caer dentro del rango de 3,0 a 3,2 µm para imitar el tamaño característico de los capilares más pequeños en la microcirculación o el IES en los bazos y medir el área de superficie, el volumen celular y el módulo de corte de la membrana del único RBC precisamente durante cada ciclo de la fatiga mecánica. El número de Reynolds de glóbulos rojos en el microtubo fue de aproximadamente 0,02. Usando las imágenes de cada célula individual deformada constantemente y moviéndose en microtubos bajo presión negativa durante la aspiración del ciclo, y suponiendo que los glóbulos rojos deformados bajo un flujo de bajo número de Reynolds en la región de movimiento constante eran axisimétricos, el área de superficie y el volumen de la Los glóbulos rojos se integraron a partir de las segmentaciones discretizadas del perfil celular deformado, es decir, el área superficial (A) y el volumen (V) se tomaron como la suma de las áreas superficiales y los volúmenes de los conos elementales, respectivamente. Realizamos experimentos de comparación uno a uno en muchos glóbulos rojos midiendo sus áreas superficiales, volúmenes y módulos de corte de membrana utilizando tanto el método microfluídico propuesto como el método de aspiración con micropipeta. En primer lugar, se aspiró una célula en un microtubo hasta que se registraron los perfiles deformados de la célula en la región de estado estacionario. En segundo lugar, al cambiar la diferencia de presión, el RBC fue expulsado del microtubo a la cámara. En tercer lugar, se aspiró el mismo RBC utilizando una pipeta de 1,8 μm, y se midieron el área superficial, el volumen celular y el módulo elástico de cizallamiento de la membrana del RBC. Descubrimos que al usar canales tubulares con un diámetro en el rango de 3,0 a 3,2 µm, los errores de A y V están por debajo del 2 % y el 9 %, respectivamente, en comparación con el uso de un método estándar de aspiración con micropipeta. También calculamos la longitud de la celda constantemente deformada (L) y la velocidad de movimiento de la celda (\({u}_{c}\)) usando las imágenes secuenciales de la celda constantemente deformada moviéndose a través de microtubos. Junto con el diámetro del tubo (D) y la velocidad del fluido dentro del canal bajo la misma presión negativa pero sin celdas (\({u}_{0}\)), usamos un método de aprendizaje automático para predecir la membrana módulo de corte elástico de los glóbulos rojos (\({E}_{s}\)). En este estudio, utilizamos un método de red neuronal entrenado con un algoritmo de retropropagación (BP), donde se adoptó una red BP de tres capas para extraer el módulo de corte de los parámetros geométricos y dinámicos observados en los experimentos.

En el presente estudio, las imágenes secuenciales de cada glóbulo rojo deformado durante el ciclo mecánico se adquieren bajo microscopía de campo brillante utilizando un objetivo de 60 × (superapocromático U Plan; apertura numérica de 60 × 1,35 NA) con un espejo doble y se graban con una cámara CMOS ( Phantom 410L, Vision Research), como se muestra en la Fig. 1a,b. La cámara funciona a 200 fotogramas por segundo (fps) con un tiempo de exposición de 1 ms y una resolución de imagen de 250 nm, con un tamaño de píxel de 0,167 μm. Se fabricó un canal tubular con un diámetro interior en el rango de 3,0 a 3,2 µm con un extractor de pipetas (P-97, Sutter Instrument) y una microforja (Narishige, MF-830), y se llenó con una solución de BSA-PBS al 1 %. antes de usar. Se usó un micromanipulador (Eppendorf, TransferMan 4r) para sostener y mover el canal con precisión a nivel nanométrico. Se preparó una cámara con un espesor de 2 mm y un rango de centímetros de largo y ancho y se colocó en la platina de un microscopio invertido (Olympus, IX73) como reservorio de suspensiones de glóbulos rojos diluidos. Las partes superior e inferior de la cámara eran cubreobjetos con un espesor de 0,16 mm y se usa silicona curada (PDMS, polidimetilsiloxano) como estructura de soporte en ambos lados del cubreobjetos en la parte inferior. La cámara se llenó con glóbulos rojos suspendidos en PBS y la fracción de volumen de los glóbulos rojos fue de alrededor del 0,01 %. Bajo la tensión superficial del líquido, el líquido se puede almacenar de forma estable en la cámara. La cámara estaba cerrada por arriba y por abajo, y solo pequeñas áreas del costado estaban expuestas al aire. La estructura semicerrada evita la evaporación y el cambio del contenido de proteína.

El ciclo mecánico de los glóbulos rojos se realizó conectando primero el canal tubular a una presión negativa (Pn = − 847 Pa) después de acercar un solo glóbulo rojo con un micromanipulador. Mientras una célula se aspiraba y fluía a través del microtubo, la presión negativa se mantuvo durante 6 s, de modo que se forma un perfil constantemente deformado del RBC en el tubo después de la contracción repentina de la cámara al microtubo (Fig. 1b). En segundo lugar, cambiamos la válvula de tres vías para cambiar la presión hidráulica en el microtubo de una presión negativa a una positiva (Pp = 480 Pa), y la presión se mantuvo durante 12 s, durante los cuales los glóbulos rojos constantemente deformados se devolvieron al interior del tubo. cámara del microtubo después de la repentina expansión (Fig. 1b). Después de ser expulsados del microtubo, los glóbulos rojos tardan en recuperarse de una forma deformada a un perfil libre de estrés, mientras amortiguan la energía de deformación a través del efecto viscoso del líquido circundante (Fig. 1b). Durante una ronda completa de 18 s en el presente modelo de ciclos mecánicos, cada glóbulo rojo tarda aproximadamente 2 s en la región de entrada del tubo para la aspiración, ~ 4 s para deformarse y moverse constantemente en el microtubo, ~ 4 s para ser expulsado de nuevo al interior del tubo. la cámara del tubo, y alrededor de 8 s para recuperarse antes de la siguiente ronda de ciclismo. En nuestros experimentos, el gradiente de presión es de aproximadamente 1 Pa/μm y similar a la condición fisiológica de IES. La velocidad de los glóbulos rojos en el microcapilar es de aproximadamente 500 μm/s y es similar a la velocidad real en los capilares.

Las simulaciones numéricas para glóbulos rojos únicos que entran y salen de un microtubo de 3 \(\mathrm{\mu m}\) de diámetro ilustran las distribuciones de tensión de la membrana durante el ciclo mecánico (Fig. 1c, d) usando los métodos de límite sumergido como se describe en Wang et al. al.25 y Jing et al.26. Ya sea que pasen a través de una hendidura esplénica in vivo o a través de un microtubo in vitro, las membranas de los glóbulos rojos experimentan una ronda de variación de estrés de la cabeza a la cola por completo, como se muestra en los resultados de la simulación de la Fig. 1d. Cerca de la entrada de la rendija o tubo (donde s = 0 en la Fig. 1d), el gradiente de distribución de tensiones a lo largo de la membrana suele ser el más grande, mientras que la tensión en la membrana en la cabeza o la cola de la celda deformada es la más concentrada como ilustrado en la Fig. 1c. Aunque las membranas de los glóbulos rojos experimentan el doble de las variaciones de estrés en un tiempo de ciclo usando el presente modelo de fatiga mientras las células aspiran y expulsan los microtubos en comparación con una célula que pasa a través de IES unidireccionalmente, no hay estrés adicional o diferente en la célula. se crea la membrana, porque las distribuciones de la tensión de la membrana durante la aspiración o el empuje de las células son casi idénticas con diferencias insignificantes desde la parte delantera hasta la parte trasera, como se muestra cuantitativamente en las simulaciones numéricas. Los glóbulos rojos se introducen en los microtúbulos repetidamente en diferentes direcciones al azar durante su ciclo, lo que significa que cualquier defecto en la membrana puede reaccionar al proceso de estrés al azar.

En comparación con otros dispositivos de microfluidos20, la principal diferencia es que la distribución de la tensión en la membrana de la célula bajo prueba es simétrica con el uso de microtubos. Los investigadores a menudo ignoran que al usar una microfluídica convencional con un canal rectangular, la tensión en la membrana celular cerca de las cuatro esquinas de la sección transversal del canal presenta concentraciones de tensión significativas, especialmente cuando se establece una ranura estrecha para que pase una célula, lo que puede introducir más concentración de tensiones cerca de la esquina de los canales rectangulares. Una de las principales ventajas de usar la configuración actual con microtubos en lugar de microfluidos con canales rectangulares es que el camino para la celda bajo prueba es simple en la entrada del microtubo, de modo que el gradiente de presión en esta abertura crucial se puede fijar con precisión en aproximadamente 1 Pa/μm y similar a la condición fisiológica de IES, sin embargo, este gradiente de presión fisiológica en las rendijas en un canal de microfluidos a menudo es difícil de corregir porque a lo largo de la dirección del flujo en el canal hay muchas pérdidas de presión fluctuantes inevitables de varios conectores y estructuras complicadas antes de que una célula alcance las ranuras cruciales. Otro beneficio del uso de los microtubos es que pudimos medir el área superficial y el volumen de los glóbulos rojos con precisión durante cada ciclo de fatiga en función de las imágenes de las células deformadas bajo supuestos simétricos.

Las limitaciones del modelo in vitro simple presente incluyen que bajo la luz fuerte para la visualización bajo el microscopio, las propiedades mecánicas de los glóbulos rojos pueden cambiar considerablemente después de 2 h de experimentos debido a los efectos térmicos de la cámara y el agotamiento de ATP. Cabe señalar que los aproximadamente 200 ciclos de nuestro modelo no son suficientes para replicar por completo todo el proceso de envejecimiento de los glóbulos rojos. No obstante, nuestro modelo puede evaluar las características principales de los cambios en las propiedades mecánicas durante las etapas iniciales de la senescencia de RBC.

Para medir los parámetros de las celdas, se utilizó el método de sustracción de fondo para identificar los contornos de RBC. Se seleccionó una imagen del microtubo sin células en movimiento como imagen de fondo. El procesamiento de umbral se utilizó para eliminar el ruido que quedaba en la región de fondo estacionaria, que era irrelevante para detectar los objetivos en movimiento. La longitud de la celda constantemente deformada (L) se calculó mediante contornos RBC y la velocidad de la celda (\({u}_{c}\)) se calculó como el desplazamiento de los centros de las celdas a lo largo del tiempo.

Asumimos que los glóbulos rojos deformados bajo el flujo bajo del número de Reynolds en la región de estado estacionario eran axisimétricos. En consecuencia, el área superficial y el volumen de los glóbulos rojos se determinaron de acuerdo con los contornos celulares; es decir, el área superficial (A) y el volumen (V) fueron las sumas de las áreas superficiales y los volúmenes de los conos elementales, respectivamente, de la siguiente manera:

donde \({D}_{left}\) y \({D}_{right}\) son los diámetros de los troncos en los lados izquierdo y derecho, respectivamente, y \(h\) es el grosor de los discretizados cono truncado.

Se recolectó sangre de voluntarios adultos sanos con una edad promedio de 27 (en el rango de 23 a 31) mediante un pinchazo en el dedo con consentimiento informado. La sangre se diluyó 1:2000 (aproximadamente 2 millones de glóbulos rojos por mililitro) en tampón salino de fosfato (PBS; sin CaCl2, sin MgCl2; pH 7,4; Gibco™) que contenía albúmina de suero bovino (BSA) al 1 % (p/v); Sigma-Aldrich) para evitar la adhesión a otras células y paredes del dispositivo. Todas las muestras de sangre se almacenaron a 4 °C antes del experimento y se analizaron dentro de las 12 h posteriores a la extracción de la muestra del dedo.

Todos los métodos se realizaron de acuerdo con las directrices y normas pertinentes y se obtuvo el consentimiento informado de todos los participantes. Todos los experimentos fueron aprobados previamente por el Comité de Ética de Ciencia y Tecnología de la Universidad Jiao Tong de Shanghai.

Los glóbulos rojos se rastrearon individualmente en función del número de ciclo de carga durante el transcurso de los experimentos. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software SPSS (IBM SPSS Statistics 22, EE. UU.); Los valores de p y el coeficiente de correlación r se calcularon mediante pruebas de correlación de Pearson de dos colas entre diferentes parámetros físicos de la misma celda y ciclos de carga. Se realizaron análisis de correlación lineal univariable para probar las asociaciones univariables de parámetros físicos y ciclos de carga, y los valores de p inferiores a 0,05 se consideraron estadísticamente significativos.

En los presentes datos experimentales obtenidos, los glóbulos rojos procedían de la sangre de la punta de los dedos de varios donantes adultos sanos. Bajo el microscopio, encontramos que los glóbulos rojos de forma bicóncava discoide constituían la porción más grande, y las células en forma de copa constituían casi la totalidad de la porción restante, mientras que los glóbulos rojos de forma rara, como los acantocitos, apenas estaban presentes. Los porcentajes medios de glóbulos rojos en formas bicóncavas y de copa son 68,3% y 31,7% respectivamente. Dado que el número de células en forma de copa es mucho mayor que el número de reticulocitos de un donante sano, que suele oscilar entre el 0,2 % y el 2 % de todos los glóbulos rojos en un estado normal, consideramos que los glóbulos rojos en forma de copa son principalmente maduros. eritrocitos con una relación de área de superficie a volumen un poco más grande que los glóbulos rojos de forma discoide bicóncava. El presente modelo de ciclo mecánico simula la fatiga mecánica y permite la observación de transiciones de formas estables entre los glóbulos rojos en forma de copa y bicóncavos in vitro (Fig. 2). Según las formas iniciales y las morfologías estables logradas después de un par de cientos de rondas de ciclos mecánicos, las transformaciones de forma de los glóbulos rojos se clasifican en tres categorías. Estos son la transformación de forma de copa a forma de copa (indicada como C-C) en la que los glóbulos rojos mantienen su forma de copa durante el ciclo mecánico, pero la altura de la concavidad disminuye gradualmente con la disminución del área superficial; la transformación de discocito en forma de copa a discocito bicóncavo (C-D) en la que los perfiles de los glóbulos rojos se transfieren de la forma inicial de copa a la forma bicóncava, y la transformación de discocito a discocito (D-D) en la que los glóbulos rojos retienen la forma discoide forma bicóncava, pero la esfericidad celular aumenta constantemente con una disminución en el área de la superficie celular.

Transiciones de forma típicas de los glóbulos rojos durante el ciclo mecánico. Las imágenes ilustran la transformación de la forma de un solo RBC con ciclos de carga (n = 0, n \(\approx\) 80, n \(\approx\) 160). En la secuencia C–C, la forma mantiene una forma de copa (superior, vista en planta; inferior, vista lateral). En la secuencia C–D, la forma mantiene un estilo de copa en el número de ciclo n = 0 y alrededor de 80 (n \(\approx\) 80), pero se transfiere a bicóncava cuando n se acerca al ciclo n \(\approx\) 160 (superior, vista en planta; inferior, vista lateral). En la secuencia D-D, la forma mantiene una forma bicóncava (superior, vista en planta; inferior, vista lateral). Barra de escala, 5 µm.

Dado que las células en forma de copa en promedio tienen una mayor relación superficie/volumen que las de forma bicóncava discoide, y el área de superficie de los glóbulos rojos a menudo disminuye monótonamente durante el envejecimiento de los glóbulos rojos2, los datos experimentales actuales de nuestras pruebas de fatiga mecánica in vitro sugieren que la fatiga mecánica induce la forma cambia unidireccionalmente de forma de copa a forma bicóncava durante el proceso de envejecimiento. Los glóbulos rojos en el grupo D-D tienen la porción más grande entre todos los glóbulos rojos muestreados de individuos sanos.

Las propiedades mecánicas de cada RBC, incluido el área superficial (A), el volumen (V) y el módulo de corte de la membrana (\({E}_{s}\)) se dedujeron y registraron para cada ciclo durante el ciclo mecánico. Como se muestra en la Fig. 3, la superficie celular (Fig. 3a) y el volumen (Fig. 3b) disminuyen linealmente con el tiempo de ciclo. Usando la relación de expansión definida como \(\mathrm{Sw}=3\mathrm{V}/4\pi {R}^{3}\), donde \(\mathrm{R}=\sqrt{A/4\ pi }\) para la esfericidad celular (es decir, \(\mathrm{Sw}=1,0\) para una esfera y \(\mathrm{Sw}=0,64\) para un glóbulo rojo sano típico con perfil discoide bicóncavo), la Fig. 3c indica que los glóbulos rojos tienden a redondearse con la reducción del área de superficie durante el ciclo mecánico, mientras que el cambio en el volumen celular a área de superficie (dV/dA) se mantiene constante (Fig. 3d). La formación de vesículas es la principal manifestación de la pérdida de membrana durante el envejecimiento celular8,27. Las vesículas desprendidas suelen tener un tamaño de 50 a 100 nm y aparecen como partículas esféricas debido al efecto de la tensión superficial. El recuadro de la Fig. 3d muestra referencias para el cambio de volumen a la pérdida de área de superficie que si los glóbulos rojos estuvieran perdiendo volumen celular solo por las vesículas esféricas con un diámetro de 0,05 μm o 1,0 μm durante el ciclo, la relación de volumen a la superficie El área después de verter vesículas debe ser paralela a las líneas marcadas con 0,05 μm o 1,0 μm respectivamente. En comparación con la pendiente del área de volumen a superficie en la Fig. 3d, la pérdida de volumen de un glóbulo rojo durante el ciclo mecánico es significativamente mayor que la encapsulada por las vesículas desprendidas, lo que indica que con la pérdida de membrana durante el ciclo mecánico, los glóbulos rojos modulan su morfologías para mantener la forma bicóncava al perder más citoplasma y dejar una superficie redundante más grande para mantener su excelente deformabilidad.

Variaciones típicas de las propiedades mecánicas de diferentes glóbulos rojos durante el ciclo mecánico. Cambios en el área superficial (a), el volumen celular (b), la relación de hinchamiento (c) y la relación entre el volumen y el área superficial con ciclos (d). Las líneas oblicuas en el triángulo en (d) representan la relación entre el volumen y el área superficial, donde se consideran las pérdidas de volumen con vesículas esféricas de 50 o 1000 nm (línea superior: 0,05 μm; línea media: 1 μm; línea inferior: los resultados experimentales actuales durante el ciclismo).

Aunque el área superficial y el volumen se reducen monótonamente durante los ciclos mecánicos, las variaciones del módulo de cizallamiento de la membrana presentan una clara dependencia de la transformación de la forma de los glóbulos rojos. Utilizando el modelo de fatiga in vitro con microtubos, los procesos de envejecimiento de estos glóbulos rojos con forma de copa y forma bicóncava se clasifican además en tres grupos diferentes. Descubrimos que aunque la rigidez de las celdas durante la fatiga es monótona para las celdas con forma bicóncava, las celdas con forma de copa podrían ablandarse o estabilizarse dependiendo de sus perfiles de forma inicial y final después de alrededor de 200 veces de ciclos de tensión-relajación a través de microtubos estrechos. Como se muestra en la Fig. 4, el módulo de corte de esos glóbulos rojos disminuye evidentemente cuando conservan su forma de copa, marcada como C-C, durante el ciclo mecánico (Fig. 4a). El módulo de cizallamiento de esos glóbulos rojos disminuye ligeramente, pero casi se mantiene constante mientras se transforman de forma de copa a discocito marcado como CD (Fig. 4b); el módulo de cizallamiento aumenta con una gran dispersión durante el ciclo mecánico para aquellos glóbulos rojos que mantienen la forma bicóncava durante el ciclo (Fig. 4c). Hasta donde sabemos, este es el primer resultado que revela, con la ayuda de un modelo de ciclo mecánico, que la rigidez de los glóbulos rojos varía en las diferentes fases del envejecimiento celular inducido por fatiga mecánica, desde la forma de copa hasta la forma bicóncava.

Cambios en el módulo de cizallamiento de la membrana durante el ciclo mecánico en diferentes grupos de transformaciones de forma (media ± error estándar), donde (a) C–C indica que los glóbulos rojos permanecen en forma de copa, (b) C–D para la transformación de forma de copa a forma de discocito y (c) D–D para glóbulos rojos que permanecen en forma de discocito. Los recuadros ilustran los cambios morfológicos típicos de diferentes grupos durante el ciclismo.

En la Fig. 5 se ilustran análisis de correlación más detallados sobre las propiedades mecánicas de los glóbulos rojos que muestran que los volúmenes de las células están estrechamente relacionados con sus áreas de superficie no solo inicialmente antes del ciclo mecánico (Fig. 5a) sino también en cualquier momento durante el ciclo (Fig. 3d) . Entre todas las propiedades mecánicas medidas en el presente trabajo, el área superficial de los glóbulos rojos, A, se selecciona como un indicador clave del envejecimiento celular durante el ciclo mecánico, no solo porque el área superficial disminuye monótonamente con el envejecimiento celular2, sino también porque es más independiente que el volumen de las células con respecto a sus ambientes mecánicos o químicos a nivel celular6,10. Entre las series de tiempo del área de superficie \({A}_{n}\) adquiridas durante los presentes experimentos de ciclos mecánicos, donde el subíndice n representa los tiempos de ciclo, el área de superficie inicial \({A}_{0} \) de un RBC antes del ciclo, \(n=0\), es un parámetro importante que, en un sentido promedio, indica la edad actual del RBC antes del ciclo mecánico. Nuestros experimentos demuestran que, además de los volúmenes celulares iniciales (Fig. 5a) y los módulos de corte de la membrana (Fig. 5b), las tasas de cambio del área superficial \({{A}^{^{\prime}}}_{0} \) y el módulo de corte \({{E}^{^{\prime}}}_{S0}\) están fuertemente correlacionados con sus áreas superficiales iniciales \({A}_{0}\) (Fig. 5c ,d) también.

Correlaciones de las propiedades mecánicas de los glóbulos rojos con sus áreas superficiales iniciales. (a) Distribución del volumen inicial \({V}_{0}\) al área de superficie inicial \({A}_{0}\) antes del ciclo mecánico. (b) Distribución del módulo de corte de la membrana inicial \({E}_{S0}\) al área inicial \({A}_{0}\). (c) Tasas de cambio del área de superficie \({{A}_{0}}^{\mathrm{^{\prime}}}=dA/dn\) durante el ciclo a su área de superficie inicial \({A}_ {0}\). (d) Tasas de cambio del módulo de corte \({E}_{s0}^{^{\prime}}=d{E}_{s}/dn\) durante el ciclo con respecto al área superficial inicial \({ A}_{0}\). Aquí, r y p en las figuras denotan los coeficientes de correlación y su significado entre las variables elegidas como coordenadas, respectivamente. azul, CC; verde, C–D; rojo, D–D.

Solo adquirimos datos de 17 celdas en el presente trabajo, entre las cuales 10 de ellas tenían inicialmente forma de copa (3 de ellas mantuvieron la forma de copa, 7 de ellas cambiaron de forma de copa a forma bicóncava), y 7 de ellas mantuvieron la forma bicóncava -en forma de todo el ciclo mecánico. El promedio y la desviación estándar del volumen, el área superficial y el módulo de corte inicial son 105,7 \(\pm\) 9,8, 143,5 \(\pm\) 11,2, 5,8 \(\pm\) 1,5 respectivamente. Dado que el presente trabajo es un estudio longitudinal basado en una sola celda frente a los ciclos de fatiga mecánica de RBC, 17 es un número relativamente pequeño del total de muestras, pero como se muestra en las Figs. 4 y 5, las desviaciones estándar de las variables medidas son bastante pequeñas, lo que sugiere que nuestras tendencias observadas son confiables.

Beneficiándonos de las propiedades mecánicas precisas de los glóbulos rojos medidos durante cada ciclo con el presente modelo de fatiga mecánica in vitro, establecimos un modelo matemático para la evolución del área superficial y el módulo de corte de glóbulos rojos individuales bajo fatiga mecánica. En nuestros experimentos, cada RBC experimentó aproximadamente 200 ciclos de fatiga mecánica dentro de las 2 horas a temperatura ambiente. En promedio, el área superficial de los glóbulos rojos disminuyó en un 10 % durante este proceso de fatiga, como se ilustra en la Fig. 3a. Los datos experimentales actuales respaldan que el área de superficie de los glóbulos rojos pierde exponencialmente durante la fatiga mecánica según las siguientes dos estimaciones relacionadas. En primer lugar, un glóbulo rojo sano en el cuerpo humano pasa a través de las hendiduras interendoteliales esplénicas (IES) alrededor de 1500 veces en total aproximadamente durante su vida útil alrededor de 120 días en promedio, porque aunque el período de circulación de sangre de pulmón a pulmón en sujetos sanos es aproximadamente 55 s, pero durante una ronda de circulación sanguínea periférica, solo alrededor del 5% del flujo arterial ingresa al bazo a través de la arteria esplénica, y entre los cuales, solo el 15% participa en la circulación abierta y lenta en la pulpa roja y cruza la estructura única de el IES según Henry et al.28. En segundo lugar, a medida que los glóbulos rojos envejecen, tienden a perder aproximadamente el 20 % de su superficie. Esta estimación provino de Waugh et al.2, quienes encontraron que al separar los glóbulos rojos jóvenes y viejos en función de su concentración media de hemoglobina celular (MCHC), el área de superficie de los glóbulos rojos jóvenes (con MCHC alrededor de 31 g/dL) era aproximadamente un 18 % más grande que la de los glóbulos rojos envejecidos (con MCHC > 37 g/dL). Vale la pena señalar que "jóvenes" y "ancianos" aquí se refieren a diferentes etapas de los glóbulos rojos durante su vida útil de aproximadamente 120 días. Es decir, al comienzo de 200 rondas de ciclos mecánicos como se realizó en los experimentos actuales, los glóbulos rojos recién extraídos en promedio ya han perdido la mitad de sus áreas de superficie gastable durante todo el proceso de envejecimiento que requiere aproximadamente 1500 rondas de ciclos.

Suponiendo que la reducción del área superficial \(A\) obedece a una caída exponencial durante el ciclo mecánico, el área superficial en cualquier ciclo mecánico n se formula como

donde \({A}_{n}\) es el área de superficie de un glóbulo rojo después del ciclo \(n\)-ésimo. \({A}_{\infty }\) es el área límite restante de un glóbulo rojo antes de que se elimine del sistema circulatorio al final de su vida útil, que es el área de superficie final en la que un glóbulo rojo decae gradualmente después de un tiempo infinito. número de ciclos teóricamente. En cuanto a los tiempos de ciclado \(n\) como índice temporal, la superficie inicialmente antes del ciclado está dada por \({A}_{0}=a{e}^{-k{n}_{0}} +{A}_{\infty }\) que presenta el estado actual de la celda. Cuando \(n=-{n}_{0}\), es decir, si pudiéramos rastrear el área de superficie de un glóbulo rojo desde el estado actual \({A}_{0}\) hasta cuando nació la célula, el área de superficie de la célula recién nacida debe ser \({A}_{b}=a+{A}_{\infty }\). Entonces, el significado biofísico de \(a\) está claro que representa el área de superficie total que un único glóbulo rojo puede perder a lo largo de todo su ciclo de vida desde el nacimiento hasta la muerte, y \(a{e}^{-k{n }_{0}}\) representa el área de superficie restante que un glóbulo rojo promedio va a perder desde su estado actual. \(k\) es el coeficiente para el decaimiento del área superficial, y asumimos que \(k\) es idéntico para todos los glóbulos rojos del mismo individuo. Entre múltiples parámetros \(\left({A}_{n},n,a,k, {n}_{0},{A}_{\infty }\right)\) en el modelo matemático para un solo RBC, \({A}_{n}\) y \(n\) se miden directamente de los presentes experimentos, y \(k\) y \({A}_{\infty }\) se obtienen mediante datos análisis, mientras que \(a\) y \({n}_{0}\) no se pueden decidir explícitamente. Aquí, se supone que n es un parámetro continuo, pero se discretiza en los experimentos en cada ronda de ciclos y mediciones.

En el presente modelo matemático se utilizan múltiples parámetros \(\left(a,k, {n}_{0},{A}_{\infty }\right)\) con significados biofísicos deterministas, pero la matriz de parámetros es difícil para resolver explícitamente cualquier RBC único con los datos experimentales actuales debido a la heterogeneidad de las células. Usando las características de la función exponencial, la tasa de cambio de la superficie celular se da de la siguiente manera

Teóricamente, un conjunto de ecuaciones para \({{A}^{^{\prime}}}_{n}\), \({A}_{n}, {A}_{\infty }\) puede formularse con los datos experimentales durante el ciclado. Sin embargo, las fluctuaciones de \({{A}^{\mathrm{^{\prime}}}}_{n}\) y \({A}_{n}\) observadas en los datos experimentales durante rondas sucesivas de ciclado (Fig. 3a) afectan la precisión de la evaluación, que provienen tanto de la inestabilidad de los flujos de fluido en el microcanal con una celda deformante como de errores en el procesamiento de la imagen. Aquí, para aprovechar los datos experimentales longitudinales de una sola célula durante el ciclo, pero evitar las fluctuaciones locales, realizamos los siguientes tratamientos.

En primer lugar, calculamos la tasa de cambio del área de superficie de un solo RBC ajustando todos los puntos de datos experimentales a lo largo de los 200 ciclos. Luego use el valor promedio resultante, indicado por \(<{{A}^{\mathrm{^{\prime}}}}_{n}>\), como la tasa de cambio inicial, \({{A}^ {\mathrm{^{\prime}}}}_{0}\approx <{{A}^{\mathrm{^{\prime}}}}_{n}>\).

Aunque asumimos que el área superficial decae exponencialmente durante todo el proceso de envejecimiento, en los presentes experimentos in vitro, cada glóbulo rojo experimenta solo alrededor de una décima parte de su ciclo de vida completo. Como resultado, la tasa de cambio podría aproximarse bajo una suposición lineal, con desviaciones aceptables dentro del rango. En segundo lugar, asumimos que el valor de k debe permanecer constante para todos los glóbulos rojos de un individuo en particular. Esto asegura que las áreas superficiales finales de los glóbulos rojos del individuo, indicadas como \({A}_{\infty }\), se puedan calcular usando la ecuación. (2), que establece que \({A}_{\infty }=({{A}^{^{\prime}}}_{0}+k{A}_{0})/k\) . Es decir, \(k\) se ajusta usando el método de mínimos cuadrados con todos los datos de glóbulos rojos de un solo individuo en el plano de (\({{A}^{^{\prime}}}_{0}, { A}_{0})\), como se muestra en la Fig. 6a. De esta manera, se puede caracterizar el \(k\) para un grupo de muestras de cada individuo particular y el \({A}_{\infty,i}\) para cada RBC individual entre estas muestras.

Modelado matemático de la dinámica de un solo área de glóbulos rojos. (a) Ajuste por mínimos cuadrados de todos los datos de glóbulos rojos de un solo individuo en el plano de (\({{A}^{^{\prime}}}_{0}, {A}_{0})\) obtener \( k\) y \({A}_{\infty }\). (b) \(\gamma\) variación en función del número de ciclos. (c) Distribuciones de \(\gamma\) para el mismo RBC durante la prueba de ciclismo. (d) Ajustes del modelo a la reducción del área en función del número de ciclos y comparaciones del área de la celda entre diferentes valores de \(\gamma\). Los puntos dispersos representan los datos experimentales (azul: \(\gamma\) = 4,18; verde: \(\gamma\)= 3,75; rojo: \(\gamma\)= 3,38 en (b–d). (e) Comparación de \(\gamma\) para tres grupos distintos de celdas. ns significa que no tiene importancia en las estadísticas.

Para describir cuantitativamente el estado de salud actual de un solo RBC, se define un parámetro de conjunto \(\gamma\) en la ecuación. (3) tomando el logaritmo natural de ambos lados de la ecuación. (1).

Este parámetro involucra el área de superficie potencial que se perderá, \(a\), el coeficiente de decaimiento exponencial del área de superficie, \(k\), y su índice de ciclo actual, \({n}_{0}\). Usando los datos experimentales de un RBC en cada ciclo de fatiga, \(\gamma\) de una celda dada se estima con \(\gamma =ln\left({A}_{n}-{A}_{\infty } \right)+kn\) como se muestra en la Fig. 6b. Se observa que \(\gamma\) fluctúa con las fluctuaciones de \({A}_{n}\) medidas.

Los datos experimentales disponibles brindan evidencia para respaldar la utilización de \(\gamma\) como un parámetro de conjunto para un solo RBC. Las medianas de \(\gamma\) en cada celda durante el ciclo mecánico parecen ser en gran medida independientes del número de ciclos, como se ilustra en la Fig. 6b. Además, los valores transitorios de \(\gamma\), que se calculan utilizando los datos experimentales instantáneos en cada ciclo, se ajustan a una distribución gaussiana, como se muestra en la Fig. 6c. Usando las medianas de \(\gamma\), la descomposición del área superficial de cada glóbulo rojo del mismo individuo durante la fatiga mecánica se puede categorizar claramente (Fig. 6d). Después de comparar los valores de \(\gamma\) para tres grupos diferentes de transformaciones de forma, el análisis estadístico no mostró diferencias significativas (Fig. 6e). Teniendo en cuenta los errores de medición en los experimentos actuales, nuestros resultados indican que el parámetro de conjunto \(\gamma\) de un solo RBC, determinado por nuestro modelo matemático, es capaz de proporcionar una distinción cuantitativa entre los comportamientos de ciclo mecánico de cada celda.

El cambio del módulo de cizallamiento de la membrana de un solo glóbulo rojo durante el proceso de fatiga mecánica es más complicado que el decaimiento monótono del área de la superficie, que varía de tres maneras distintas asociadas con las tres transformaciones de forma de celda diferentes, como se muestra en la Fig. 4. Y la Fig. .5d presenta que la tasa de cambio del módulo de corte de un solo RBC al comienzo del ciclo mecánico, \({{E}^{^{\prime}}}_{0}\) se correlaciona linealmente con su área inicial , \({A}_{0}\), como

donde \(g\) es la tasa de cambio lineal y \(C\) es una constante. Generalizamos esta correlación lineal entre la tasa de cambio del módulo de cizallamiento de la membrana y el área superficial desde el estado inicial de las células hasta cualquier estado actual de los glóbulos rojos, y asumimos que \(g\) se mantiene constante para todos los glóbulos rojos de un individuo como un individuo. característica como

Tomando la ecuación. (1) en (5), e integrando la ecuación con las condiciones iniciales \({Es}_{n}={Es}_{0}\) y \({A}_{n}={A}_ {0}\) en \(n=0\), el módulo de corte de la membrana a lo largo del proceso de fatiga mecánica se formula como

donde \(C\) es una constante que asume diferentes valores para diferentes celdas. Esta formulación del módulo de corte de la membrana consta de una parte de disminución exponencial y una parte de crecimiento lineal juntas, que determinan conjuntamente la variación del módulo de corte con respecto a la fatiga mecánica en cualquier tiempo de ciclo \(n\).

El modelo presentado en la Ec. (6) ilustra tres tendencias distintas para el cambio del módulo de corte, como se demuestra en la Fig. 5. Estas tendencias dependen de dos factores: \({A}_{0}\) y g. Si \({A}_{0}<-C/g\), el módulo de corte inicialmente disminuye con el ciclo mecánico (\({{Es}^{^{\prime}}}_{0}<0\) ). Por el contrario, si \({A}_{0}>-C/g\), el módulo de cortante aumenta (\({{Es}^{^{\prime}}}_{0}>0\)). Si \({A}_{0}=-C/g\), el módulo de cortante permanece constante (\(Es_{0}^{^{\prime}} = 0\)). Expresando el módulo de corte en términos del área superficial,

que contiene los cambios en el módulo de corte con transformaciones de forma durante los procesos de fatiga mecánica de un solo RBC.

La Figura 7a muestra que la Ec. (6) se aproxima mucho a los datos experimentales con el \(g\) determinado mediante la adopción de las tasas de cambio del módulo de corte de múltiples RBC como una constante del mismo individuo. La figura 7a también revela que durante el proceso de fatiga de un solo glóbulo rojo, el módulo de cizallamiento de la membrana primero disminuye mientras su perfil de forma se transforma de copa a forma de discocito, y luego aumenta a medida que mantiene formas bicóncavas discoides.

Comparación del modelo matemático (línea continua) del módulo de corte de la membrana con datos experimentales (puntos dispersos) bajo diferentes transformaciones de forma. (a) Variación del módulo de corte durante ciclos mecánicos. Los diferentes colores y estilos de línea representan diferentes transformaciones de formas asociadas con los procesos cíclicos. (b) Relación del módulo de corte con el área superficial durante el ciclo mecánico con tres celdas diferentes bajo diferentes transformaciones de forma durante el ciclo de forma de copa a forma de copa (diamantes), de forma de copa a forma de discoide bicóncava (cuadrados) y discoide bicóncava De forma discoide a bicóncava (círculos) respectivamente. La flecha ilustra la dirección del proceso de envejecimiento usando el número de ciclos n como índice, la línea de puntos y puntos presenta una expectativa para una celda durante un proceso de ciclo largo basado en la ecuación. (7).

Como se muestra en la Fig. 7b, las líneas sólidas y los puntos de dispersión presentan la predicción del modelo y los datos experimentales de tres celdas diferentes bajo tres transformaciones de formas distintas, respectivamente, lo que ilustra que la ecuación. (7) es capaz de predecir el cambio del módulo de corte de la membrana asociado con la variación del área superficial durante el proceso de fatiga aproximadamente. La Figura 7b respalda que un solo RBC a menudo contiene un área de superficie más grande con forma de copa, y comienza a perder el área de superficie con un desvanecimiento de la forma de copa, mientras tanto, el módulo de corte de la membrana disminuye. El ablandamiento de la membrana de los glóbulos rojos cesa cuando las células en forma de copa se transforman en una forma discoide. Durante esta transformación, los glóbulos rojos continúan perdiendo área superficial, pero el módulo de corte permanece relativamente constante y no presenta cambios significativos en torno a su valor mínimo a lo largo de su vida útil. Después de que los glóbulos rojos obtienen su forma bicóncava discoide, los glóbulos rojos comienzan a endurecerse durante el proceso de fatiga mecánica, de modo que sus áreas superficiales se reducen y los módulos de corte de la membrana aumentan.

En el presente trabajo, para cada tipo de transformaciones de forma, incluidas copa-taza, copa-discocito y discocito-discocito, llevamos a cabo múltiples experimentos celulares como se muestra en la Fig. 4 y las tendencias generales de cada tipo son consistentes. Limitados por las condiciones experimentales actuales, los experimentos de fatiga a largo plazo para una sola celda no son compatibles con la configuración actual, por lo que no pudimos observar una medición directa de todo el proceso de fatiga en una celda determinada. Sin embargo, mientras juntamos tres categorías distintas, está claro que los tres grupos de datos juntos forman una forma parabólica, como se muestra en la Fig. 7b. Los modelos físicos presentados usando las Ecs. (1), (6) y (7) basados en los presentes datos experimentales son simples. Los parámetros adoptados aquí son biofísicamente significativos y reflejan ciertas características básicas de los glóbulos rojos con diferencias individuales de las células y la aptitud de cada célula si pertenece a la misma persona. Aunque actualmente no pudimos presentar un proceso de envejecimiento completo con una celda dada, la Fig. 7b y la línea de puntos y guiones como la tendencia esperada en la figura requieren configuraciones más avanzadas para experimentos de fatiga mecánica de una sola celda más sofisticados.

La estimulación mecánica de los glóbulos rojos es crucial para el envejecimiento de los glóbulos rojos29. Sin embargo, todavía faltan medios cuantitativos para estudiar estos efectos de la estimulación mecánica sobre las propiedades mecánicas de los eritrocitos individuales. El modelo de fatiga con microtubos propuesto en este estudio no solo reconstruye las estimulaciones de estrés circunferencialmente más simétricas mientras los glóbulos rojos pasan repetidamente a través de capilares estrechos y hendiduras in vivo, sino que también caracteriza los cambios de las propiedades mecánicas de los glóbulos rojos cuantitativamente después de cada evento de fatiga a través de métodos hidrodinámicos in situ. .

Durante el ciclo, la estimulación mecánica induce cambios en la morfología de los glóbulos rojos, lo que conduce a una disminución en el área y el volumen de los glóbulos rojos, así como a modificaciones en el módulo de corte de la membrana de los glóbulos rojos. Las alteraciones en las propiedades mecánicas de los eritrocitos observadas en nuestro estudio son similares a las observadas en el proceso de envejecimiento11,12,13,14. Se propone que la fatiga mecánica es la causa principal de los cambios en la degradación mecánica de los glóbulos rojos observados en diferentes grupos de edad. En consecuencia, nuestro modelo proporciona una explicación de cómo los estímulos mecánicos contribuyen al proceso de envejecimiento de los glóbulos rojos. El presente modelo de ciclo mecánico respalda estudios en profundidad de los problemas fisiológicos y clínicos relacionados con el envejecimiento de los glóbulos rojos.

La transformación de los reticulocitos en eritrocitos maduros pasa por tres fases distintas, que incluyen la estructura reticular R1 (reticulada, que contiene ARN, superficie rugosa), la estructura en forma de copa R2 (en forma de copa, que contiene ARN, superficie rugosa) y los glóbulos rojos maduros (doble plato cóncavo). forma) 7. Inspirándose en el análisis morfológico de los eritrocitos humanos30,31, los investigadores especularon que existe una fase de transición R3 (copa, libre de ARN, superficie lisa) entre el R2 y los eritrocitos maduros32. Después de realizar nuestros experimentos actuales, hemos descubierto que los glóbulos rojos en forma de copa pueden transformarse en un discocito de forma bicóncava a través del ciclo mecánico. Este proceso hace que el módulo de corte disminuya hasta que la rigidez de RBC alcanza su valor mínimo durante su vida útil. La forma bicóncava discoide es una de las formas más estables con la menor cantidad de energía requerida durante el proceso de transformación de la forma de los glóbulos rojos. Además, la deformabilidad y la estabilidad de los glóbulos rojos aumentan durante la transformación de copa a discocito. Estas características pueden ayudar a explicar las observaciones sobre la maduración de los reticulocitos, que muestran una rápida disminución en el área y el volumen de los glóbulos rojos, mientras que su deformabilidad celular y estabilidad mecánica aumentan33. Por lo tanto, los resultados experimentales junto con el modelo de fatiga sugieren que la transformación de la forma de copas en discocitos es probablemente una fase intermedia en la maduración de los reticulocitos en glóbulos rojos maduros, lo que es útil para el estudio de los glóbulos rojos generados in vitro.

Los glóbulos rojos participan en los procesos patológicos de numerosas enfermedades circulatorias y metabólicas34,35. En combinación con la estimulación mecánica, la inflamación y otras estimulaciones bioquímicas también afectan el envejecimiento de los glóbulos rojos, lo que brinda un gran potencial para el diagnóstico y tratamiento de enfermedades mediante el control de las propiedades mecánicas de los glóbulos rojos. Aquí, configuramos un modelo matemático para la evolución de la superficie y el módulo de corte de un solo RBC basado en el proceso de envejecimiento de los RBC in vitro. Los parámetros, incluida la tasa de descomposición del área superficial y la tasa de cambio concomitante del módulo de cizallamiento, son propiedades intrínsecas de los glóbulos rojos que son indicadores potenciales para describir cuantitativamente las diferencias de los glóbulos rojos en diferentes enfermedades.

Por ejemplo, la disminución de la deformabilidad y estabilidad de la membrana debido a factores genéticos en las anemias hemolíticas (p. ej., talasemia, esferocitosis hereditaria) a menudo se ve deteriorada por estimulaciones mecánicas en el bazo5. Empleando el modelo matemático propuesto, podemos diferenciar cuantitativamente las propiedades intrínsecas de los glóbulos rojos en diferentes enfermedades hereditarias de la sangre. Aquí, k describe la capacidad de los glóbulos rojos de resistir el cambio de área superficial para mantener un estado estacionario, y g refleja la tasa de rigidez de los glóbulos rojos debido a la remodelación del citoesqueleto. Estos parámetros sugieren un enfoque novedoso para diagnosticar y monitorear enfermedades hemolíticas con variaciones anormales del área de superficie y rigidez durante el ciclo mecánico.

Otra aplicación potencial es comprobar el efecto de la glucosa en sangre sobre el envejecimiento de los glóbulos rojos. La hemoglobina glicosilada (HbA1c) en pacientes diabéticos está estrechamente relacionada con la edad de los glóbulos rojos36. Con el parámetro de conjunto \(\upgamma\) para estimar las edades de los glóbulos rojos, la HbA1c podría controlarse de forma más dinámica en unas pocas horas utilizando el modo de fatiga actual para acelerar el proceso de envejecimiento en entornos bioquímicos similares. Sin embargo, todas estas aplicaciones potenciales requieren una mayor acumulación de datos y configuraciones experimentales más sofisticadas para las pruebas a largo plazo de glóbulos rojos individuales con estudios de control apropiados.

Establecimos un único modelo de ciclo mecánico de glóbulos rojos para imitar la estimulación mecánica de los glóbulos rojos in vivo. El modelo emplea condiciones de estrés isotrópico para los glóbulos rojos que pasan repetidamente a través de lúmenes estrechos, como pequeños capilares en la microcirculación o IES en el bazo, para imitar de manera efectiva el envejecimiento de las células a través de la pérdida de superficie. Además, proporciona mediciones in situ y precisas del área superficial y el módulo de corte de la membrana durante cada ronda de ciclos mecánicos. Al utilizar un modelo de fatiga in vitro, hemos clasificado los procesos de ciclo de RBC maduros en tres grupos distintos, en función de sus respectivos cambios de forma entre forma de copa y forma bicóncava. Aunque la rigidez de las células durante la fatiga es monótona para los glóbulos rojos con forma bicóncava, las células con forma de copa podrían ablandarse o estabilizarse dependiendo de sus perfiles de forma inicial y final bajo el ciclo mecánico. También propusimos formulaciones matemáticas basadas en datos experimentales para aproximar e interpretar la evolución de las propiedades mecánicas de los glóbulos rojos maduros. Los modelos matemáticos para el cambio del área de superficie y el módulo de corte de la membrana de los glóbulos rojos individuales respaldan un parámetro de conjunto para estimar cuantitativamente el estado de salud de los glóbulos rojos.

Todos los datos están disponibles en el texto principal.

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Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Subvención 12072198), el Proyecto Nacional de Investigación y Desarrollo Clave de China (2017YFE0117100) y la Universidad Jiao Tong de Shanghai (No. YG2022ZD004). También reconocemos el apoyo parcial del MIT Greater China Fund for Innovation.

Laboratorio clave de hidrodinámica (Ministerio de Educación), Departamento de Ingeniería Mecánica, Escuela de Arquitectura Naval, Océano e Ingeniería Civil, Universidad Jiao Tong de Shanghái, Shanghái, 200240, China

Qiaodong Wei, Xiaolong Wang y Xiaobo Gong

Instituto de Fotónica y Tecnología de Fotones, Laboratorio Estatal Clave de Tecnología de Fotones en Energía de China Occidental, Universidad del Noroeste, Xi'an, 710100, China

ce zhang

Departamento de Ciencia e Ingeniería de Materiales, Instituto de Tecnología de Massachusetts, Cambridge, MA, 02139, EE. UU.

ming dao

State Key Laboratory of Ocean Engineering, School of Naval Architecture, Ocean and Civil Engineering, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai, 200240, China

xiaobo gong

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QW, XG concibió el proyecto. QW desarrolló la configuración experimental y realizó experimentos. XW proporcionó cálculo de simulación. QW, CZ y XG analizaron los datos, QW, XG escribieron el manuscrito. MD y XG supervisó la investigación. Todos los autores revisaron el manuscrito.

Correspondencia a Xiaobo Gong.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Wei, Q., Wang, X., Zhang, C. et al. Evolución del área superficial y el módulo de cizallamiento de la membrana de los glóbulos rojos humanos maduros durante la fatiga mecánica. Informe científico 13, 8563 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-34605-x

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Recibido: 15 Septiembre 2022

Aceptado: 04 mayo 2023

Publicado: 26 mayo 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-34605-x

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