La exocitosis de la pared celular silicificada de las diatomeas implica una extensa desintegración de la membrana.

Nature Communications volumen 14, Número de artículo: 480 (2023) Citar este artículo

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Las diatomeas son algas unicelulares caracterizadas por paredes celulares de sílice. Se sabe que estos elementos de sílice se forman intracelularmente en vesículas de deposición de sílice unidas a la membrana y se exocitosan después de su finalización. Se desconoce cómo las diatomeas mantienen la homeostasis de la membrana durante la exocitosis de estos elementos de sílice grandes y rígidos. Aquí estudiamos la dinámica de la membrana durante la formación de la pared celular y la exocitosis en dos especies de diatomeas modelo, utilizando microscopía confocal de células vivas, microscopía electrónica de transmisión y tomografía crioelectrónica. Nuestros resultados muestran que durante su formación, la fase mineral está en estrecha asociación con las membranas vesiculares de depósito de sílice, que forman un molde preciso de los delicados patrones geométricos. Encontramos que durante la exocitosis, la membrana de la vesícula de depósito de sílice distal y la membrana plasmática se separan gradualmente del mineral y se desintegran en el espacio extracelular, sin ninguna recuperación endocítica notable o reutilización extracelular. Demostramos que dentro de la célula, la membrana vesicular de depósito de sílice proximal se convierte en la nueva barrera entre la célula y su entorno, y asume el papel de una nueva membrana plasmática. Estos resultados proporcionan observaciones estructurales directas de la exocitosis de sílice de diatomeas y apuntan a un mecanismo extraordinario en el que la homeostasis de la membrana se mantiene descartando, en lugar de reciclar, parches de membrana significativos.

Las diatomeas son un grupo diverso de algas unicelulares caracterizadas por paredes celulares de sílice con formas intrincadas específicas de la especie y patrones de poros jerárquicos1. A pesar de la inmensa diversidad morfológica entre las especies, la mayoría de las paredes de las células de diatomeas tienen un diseño conservado de dos "capas" de sílice de forma similar que se superponen parcialmente, como una placa de Petri. Cada 'caparazón' consta en sí mismo de una válvula y una serie de fajas. Las valvas suelen definir la forma de la celda, están ricamente ornamentadas y contienen patrones de poros jerárquicos. Las fajas forman anillos parcialmente superpuestos que rodean las paredes laterales de las celdas.

La formación de la pared celular de diatomeas está bajo control biológico y está vinculada al ciclo celular2,3,4,5. Cada célula hija hereda la mitad de la pared celular parental y forma una segunda válvula directamente después de la división celular. Se forman nuevas bandas de cintura y se unen a la nueva válvula durante el crecimiento de la célula (Fig. S1). La silicificación suele ser un proceso intracelular que tiene lugar dentro de un orgánulo unido a una membrana, la vesícula de depósito de sílice (SDV)6,7,8. Los SDV son orgánulos delgados y alargados, ubicados debajo de la membrana plasmática. La célula regula el entorno químico dentro de la SDV, ejerciendo así un estricto control sobre el proceso de silicificación, lo que da como resultado arquitecturas de pared celular altamente específicas y reproducibles9,10,11,12,13. Después de la maduración intracelular, los elementos de sílice se exocitan para cubrir la superficie celular6,14. Tales eventos de exocitosis son excepcionales en biología celular ya que el contenido del SDV es una enorme estructura sólida que necesita ser secretada sin dañar la integridad de la célula.

En las vías de exocitosis clásicas, la membrana de una vesícula intracelular se fusiona con la membrana plasmática para llevar su contenido al espacio extracelular. La homeostasis de la membrana plasmática se puede mantener mediante una fusión transitoria que evita que la vesícula secretora se integre con la membrana plasmática, o compensando la membrana añadida mediante endocitosis compensatoria15. Sin embargo, debido a su gran tamaño y rigidez, la secreción de las paredes celulares de las diatomeas supone un gran desafío para el organismo. La nueva válvula cubre hasta la mitad de la superficie celular total (Fig. S1) y, por lo tanto, el área de superficie de la membrana SDV es similar a la membrana plasmática completa. Por lo tanto, la fusión con la membrana SDV conduciría a una duplicación casi instantánea del área de la membrana plasmática.

Si bien estudios anteriores han presentado varias hipótesis sobre la exocitosis de la pared celular de sílice en diatomeas14,16,17,18,19,20,21,22,23 (Fig. S2), importantes desafíos experimentales han obstaculizado un mayor progreso. Por un lado, la preparación tradicional de muestras para estudios ultraestructurales con microscopía electrónica provoca artefactos como el encogimiento de la membrana y la deformación de la estructura24. Por otro lado, las ventajas de la microscopía óptica para estudiar los aspectos dinámicos de la formación de la pared celular en células vivas están limitadas por la baja resolución espacial y la escasez de herramientas de biología molecular para diatomeas25,26. Debido a estas limitaciones, las observaciones in situ del SDV en el contexto celular son escasas y falta evidencia directa de la naturaleza del proceso de silicificación y exocitosis.

En este estudio, investigamos la dinámica de la membrana durante la formación de válvulas y la exocitosis en dos especies de diatomeas modelo, Stephanopyxis turris y Thalassiosira pseudonana, utilizando microscopía de fluorescencia confocal de células vivas, microscopía electrónica de transmisión (TEM) y tomografía crioelectrónica (crio-ET). Las células relativamente grandes de S. turris tienen estructuras de sílice fácilmente discernibles, lo que permite observaciones detalladas de válvulas individuales y el desarrollo dinámico de sus características arquitectónicas mediante microscopía de fluorescencia27,28. Además, usando cryo-ET obtenemos datos 3D de alta resolución del SDV en T. pseudonana, en condiciones nativas29,30. Nuestros resultados indican que la exocitosis de la válvula en ambas especies implica la desintegración de las membranas distales, acompañada de la reutilización de la membrana SDV proximal en una nueva membrana plasmática.

Investigamos la exocitosis de válvulas en diatomeas mediante el estudio de dos especies, S. turris y T. pseudonana (Fig. 1). Las valvas de S. turris tienen forma de cápsula y una estructura de dos capas. La capa proximal es delgada, perforada por poros de tamaño nanométrico, y en el lado distal está cubierta por una capa más elevada que forma polígonos grandes (Fig. 1a', a"). La parte superior de la capa poligonal está aplanada, formando un ' Forma de T' en sección transversal (Fig. 1a"'). Las células de S. turris forman cadenas que están unidas a través de extensiones tubulares de sílice que se extienden desde el vértice de las valvas (Fig. 1a, flecha). Las células de T. pseudonana tienen forma de barril y son mucho más pequeñas, las válvulas son discos con un diámetro de aproximadamente 5 μm (Fig. 1b). Pequeños poros perforan la capa de sílice que se extiende por el área entre las nervaduras radiales, y poros tubulares más grandes, llamados fultoportulae, decoran el borde de la válvula7 (Fig. 1b', b"). Las Figuras 1e y f muestran células en división durante y poco después , formación de válvulas. Las válvulas recién formadas se tiñen con PDMPO, un colorante fluorescente que se incorpora a la sílice durante el proceso de mineralización biológica. paredes celulares de sílice (Fig. 1g, h).

a, b Imágenes SEM que representan al menos dos muestras. Los detalles de las estructuras de las válvulas de sílice se muestran con mayores aumentos en los subpaneles. c, d Imágenes de microscopio óptico de campo claro de dos células de S. turris en una cadena conectada a través de extensiones de enlace y varias células de T. pseudonana en diferentes etapas durante el ciclo celular. e, f Imagen de fluorescencia de PDMPO de dos células hijas diferentes de S. turris durante la formación de la válvula, y las mismas células de T. pseudonana que en (d) con nuevas válvulas teñidas con fluorescencia por PDMPO. Los resultados de cuatro experimentos de sincronización se muestran en la Fig. S3. g, h Esquema de S. turris y T. pseudonana que representa la situación poco antes de la exocitosis de las válvulas formadas intracelularmente. Barras de escala: 10 μm (a, c, e), 5 μm (d, f), 1 μm (a', a"', b) 500 nm (a"), 100 nm (b', b").

Estudiamos la dinámica de la membrana en S. turris usando microscopía confocal de lapso de tiempo de células vivas (Fig. 2). Los cultivos sincronizados se marcaron con PDMPO para rastrear la formación de sílice (Fig. S3) y con FM4-64 para teñir la membrana plasmática. FM4-64 es un colorante fluorescente anfifílico que se integra en la membrana plasmática32. A diferencia de tintes similares, como FM1-43 que se internaliza rápidamente en una diatomea diferente33, FM4-64 marca solo la membrana plasmática y no se infiltra pasivamente en las células de S. turris (Fig. S4). Durante la silicificación, las señales de PDMPO y FM4-64 casi se colocalizan hasta la resolución del microscopio confocal (Fig. 2a). Esto demuestra una proximidad muy estrecha entre la membrana plasmática y las estructuras de sílice en crecimiento dentro de la SDV, es decir, que la membrana plasmática reviste la forma de la SDV. Sin embargo, las puntas de crecimiento de las extensiones de enlace se tiñen solo con el tinte de la membrana, lo que indica que el alargamiento de SDV precede a la silicificación de sus partes más marginales (Fig. 2a, flecha).

a, b Imágenes superpuestas de canales de fluorescencia. a', b' Imágenes de fluorescencia FM4-64 de un solo canal. a–a' Células hijas durante la formación de la válvula marcadas con FM4-64 y PDMPO. Las membranas delimitan los polígonos en crecimiento y lideran el crecimiento de las extensiones de enlace (flecha). b Instantáneas de un lapso de tiempo de células hijas que atraviesan la formación de válvulas y la exocitosis y están etiquetadas solo con FM4-64. El tiempo transcurrido desde el inicio de la formación de imágenes se indica en la imagen. b' Vista recortada y ampliada de una sola extensión de enlace de la celda en b (indicada con recuadros). El inicio de la exocitosis de la válvula se puede ver a partir de t = 132, después de lo cual los restos de membrana alrededor de la extensión de enlace ya no están conectados a la célula y se desintegran gradualmente. Barras de escala: 20 μm (a, a'), 10 μm (b) y 1 μm (b').

Registramos un lapso de tiempo de la dinámica de la membrana en las células de S. turris durante todo el proceso de formación de válvulas y exocitosis (Fig. 2b, Película S1). La silicificación comienza en el ápice de la célula y avanza radialmente. El progreso de la formación de la válvula se visualiza mediante la membrana de plasma fluorescente que delinea la capa de sílice poligonal en crecimiento y las extensiones de enlace (Fig. 2b, t = 0 a t = 126). El inicio de la exocitosis, es decir, el aflojamiento del complejo de sílice de la membrana plasmática, SDV, es evidente ya que la membrana plasmática marcada ya no delimita claramente los polígonos (Fig. 2b, t = 132). Al mismo tiempo, observamos una mejora de la señal fluorescente (Fig. S5), probablemente debido a la fusión entre el plasma y las membranas de SDV que expone el lumen de SDV al medio circundante, desde el cual FM4-64 libre puede infiltrarse y teñirse. la membrana SDV además de la membrana plasmática. Sin embargo, la resolución limitada de la microscopía de fluorescencia no permite resolver espacialmente la interacción entre el SDV y las membranas plasmáticas antes y después de la exocitosis (Fig. S6).

Las extensiones de enlace de S. turris presentan una oportunidad única para investigar el proceso de exocitosis, ya que la membrana plasmática vieja rodea estas estructuras largas antes de la exocitosis, pero después de la exocitosis, la nueva membrana plasmática está solo en su base. La señal FM4-64 alrededor de las extensiones de enlace es continua durante su crecimiento, pero después de que las extensiones alcanzan su tamaño completo, la señal fluorescente cambia a parches interrumpidos que desaparecen gradualmente (Fig. 2b, t = 156 y t = 234). Esto está de acuerdo con un estudio de fluorescencia de membrana informado previamente de Coscinodiscus wailesii33. En algunos casos, las membranas que rodean una extensión de enlace claramente ya no están conectadas al cuerpo celular (Fig. 2b'). Este patrón de marcaje, en el que parches de membranas teñidas se desconectan de la célula, es muy diferente de la expectativa de un proceso de exocitosis clásico en el que las membranas teñidas deben retirarse y reciclarse dentro de la célula. Es importante señalar que FM4-64 está presente en el medio durante todo el experimento, pero solo se vuelve fluorescente en un entorno lipídico32. Por lo tanto, solo etiqueta membranas estructuralmente intactas y cuando una membrana se desintegra, ya no etiquetará los desechos malformados. Por lo tanto, estas observaciones apuntan a un escenario en el que las principales fracciones de las membranas distales se separan por completo de la superficie celular principal, se desintegran gradualmente y pierden su marcado fluorescente en el espacio extracelular entre las células hijas recién divididas.

Para observar el mismo proceso a resolución ultraestructural, preparamos células de S. turris en división para el análisis TEM. En resumen, las células sincronizadas se vitrificaron mediante congelación a alta presión y, posteriormente, se sustituyeron por congelación y se incrustaron en resina. Esto da como resultado una combinación óptima de conservación de estructuras subcelulares en un estado cercano al nativo junto con la capacidad de obtención de imágenes TEM de alto rendimiento a temperatura ambiente. Las imágenes TEM de células de S. turris preparadas de acuerdo con este procedimiento muestran una conservación excepcional del entorno celular y, en particular, de las membranas y los contenidos inorgánicos del SDV (Fig. S7).

Adquirimos cientos de imágenes de 227 células en diferentes etapas del ciclo celular y, al categorizar y ordenar estas imágenes, reconstruimos una línea de tiempo de formación de válvulas y exocitosis en S. turris (Fig. 3). Las células con un SDV que contenía una válvula en crecimiento se clasificaron como en la etapa de formación de la válvula (n = 61, ejemplos presentados en la Fig. 3a-b"). En estas etapas, tres bicapas lipídicas, las membranas SDV proximal y distal, así como como la membrana plasmática, se puede distinguir claramente La membrana SDV distal está muy cerca de la membrana plasmática, con una distancia de solo 10-30 nm (Fig. 3a "recuadro). Durante la formación temprana de la válvula, la SDV se extiende solo hasta donde ha avanzado la deposición de sílice (Fig. 3a). A medida que la precipitación de sílice avanza radialmente, la SDV se expande con ella. Después de la formación de la capa base porosa, la capa poligonal se forma en su lado distal (Fig. 3b–b", flecha). Durante todo el proceso de silicificación, la membrana SDV delinea firmemente la válvula en crecimiento, formando un espacio muy confinado en el que la morfología de la sílice está bajo el control de la membrana SDV. La válvula alcanza su morfología final mientras aún está completamente encerrada en la SDV, observamos 23 células con una SDV intacta que contiene una válvula completamente madura (Fig. 3c-c").

La columna de la izquierda muestra una imagen representativa de cada etapa, con vistas de mayor aumento de las áreas encuadradas en las columnas de la derecha. a La formación de la válvula comienza en el vértice de la célula. a' Sílice en crecimiento dentro del SDV que se encuentra directamente debajo de la membrana plasmática. a" La SDV termina en el borde de sílice en crecimiento. El recuadro muestra las bicapas de la SDV proximal (púrpura) y distal (rosa) y la membrana plasmática (amarilla) con mayor aumento. b Más tarde, durante la formación de la válvula, b' la capa poligonal (flecha) se forma encima de la capa base, y b" el borde de crecimiento de la nueva valva alcanza el borde de la valva original. c La silicificación de la nueva válvula se completa mientras aún está completamente encerrada en la SDV. Las válvulas maduras se pueden reconocer por: c' la capa poligonal completamente formada y aplanada, y c" una forma de gancho pronunciada en el borde de la válvula (flecha). d Al inicio de la exocitosis, d' las membranas todavía rodean la mayor parte de la válvula nueva , d" pero ya no forman un recinto completo (puntas de flecha). e Poco después de la exocitosis, e' las membranas distales pierden su integridad estructural (puntas de flecha), y e" la membrana plasmática es ahora continua (flecha) debajo de la nueva válvula. f–f" Después de completar la exocitosis (n = 75), hay no quedan rastros de los restos de la membrana distal. A la derecha de las imágenes, una tabla resume la cantidad de células observadas en cada etapa de desarrollo y la cantidad de casos en los que hubo invaginaciones de membrana (ver detalles en la Fig. S8 y el texto principal). Las barras de escala representan 5 μm (a–f), 1 μm (d', e', f'), 500 nm (a', c', c", d", e", f"), 200 nm (a ", b', b", c' recuadro) y 50 nm (a" recuadro).

En imágenes de 68 células, observamos una válvula madura que está rodeada por membranas SDV con algunas discontinuidades, es decir, SDV no forma un recinto completo. Sobre la base de esta información estructural, definimos estas células como exocitosis. Estas discontinuidades de la membrana pueden ser muy locales, mientras que la mayoría de la válvula todavía está estrechamente encerrada por la SDV (Fig. 3d-d"). En una etapa posterior, la ultraestructura de la membrana cambia drásticamente. La delimitación estrecha de la SDV distal y el plasma la membrana alrededor de la válvula se afloja y observamos el deterioro de la integridad estructural de las membranas distales (Fig. 3e-e"). La membrana en el lado proximal de la válvula ahora se continúa con la membrana plasmática debajo de la válvula parental (Fig. 3e "flecha). Al final del proceso de exocitosis, las nuevas válvulas pueden reconocerse debido a su posición debajo de la faja parental. bandas, mientras que no se ven rastros visibles de las membranas fuera del citoplasma (n = 75, Fig. 3f-f").

Analizamos los datos de microscopía de la membrana proximal a las válvulas recién formadas para identificar posibles signos de recuperación de la membrana endocítica que podrían estar asociados con el reciclaje de las membranas SDV. Observamos siete ocasiones de invaginaciones de membrana en células en la etapa de exocitosis. El tamaño de estas invaginaciones varía de 0,5 a 3 μm (Fig. S8). Sin embargo, dichas invaginaciones se detectaron en todas las etapas de formación de válvulas y exocitosis con una ocurrencia similar (Χ2 (df=2, N=152) = 2,23, p = 0,327) y, por lo tanto, no se pueden correlacionar con el reciclaje de membranas después de la exocitosis. En general, los datos de TEM están de acuerdo con las imágenes de células vivas, lo que sugiere que durante la exocitosis de la válvula, las membranas distales se desintegran extracelularmente sin signos de recuperación, mientras que la única membrana visible proximal a la nueva válvula es la membrana SDV proximal.

Para visualizar la organización celular lo más cerca posible del estado nativo, adquirimos datos de tomografía crioelectrónica (crio-ET) de células de T. pseudonana que experimentan exocitosis de válvula. El tamaño más pequeño de estas células las hace adecuadas para los pasos necesarios de preparación de muestras para obtener imágenes con cryo-ET. En resumen, vitrificamos células de T. pseudonana sincronizadas mediante congelación por inmersión, preparamos láminas delgadas mediante un haz de iones enfocado y luego recolectamos tomografías electrónicas en condiciones criogénicas30,34. De los 59 pares de células hijas de las que se tomaron imágenes, 15 estaban durante o poco después de la exocitosis de la válvula, es decir, antes de la exocitosis del primer conjunto de bandas de cintura. Cuatro de ellos ocurrieron durante las primeras etapas de la exocitosis, con la nueva válvula cubierta solo parcialmente por las membranas SDV (Fig. 4a-d).

a, c, e Rebanadas a través de volúmenes 3D reconstruidos; algunas características en los rectángulos resaltados están coloreadas artificialmente de acuerdo con el código de color en b (membrana pSDV - membrana SDV proximal, membrana dSDV - membrana SDV distal). b, d Representación tridimensional de superficies de volúmenes segmentados. f Esquema que muestra el mecanismo propuesto de exocitosis de válvula de diatomeas. ayc muestran diferentes ubicaciones en las mismas células hijas, indicadas en f. Barras de escala: 100 nm, grosor de corte de 1,15 a 5,7 nm. Ver también Películas T2, 3.

La Figura 4a, c muestra tomogramas de diferentes ubicaciones del mismo par de células hijas ligeramente desincronizadas, la izquierda poco antes de la exocitosis y la derecha durante la exocitosis. La válvula del lado izquierdo todavía está completamente encerrada dentro de la SDV, mientras que la válvula del lado derecho ya está expuesta al espacio extracelular a través de discontinuidades en la cobertura de las membranas distales. En ambas células, se distinguen tres bicapas lipídicas. En la célula hija, antes de la exocitosis, se observa la disposición esperada de las membranas: la membrana plasmática cubre toda la célula y, muy cerca por debajo, las membranas SDV rodean completamente la válvula (Fig. 4a, b, lado izquierdo). Sin embargo, durante la exocitosis, las membranas distales se han fusionado en múltiples sitios, formando una red de sacos membranosos planos, lo que hace que la membrana del lado proximal de la válvula sea el límite más externo de la célula (Fig. 4a, b, lado derecho). Una situación similar se observa en la periferia de la válvula, donde se observan estructuras membranosas no conectadas en el lado distal de la fultoportula (Fig. 4c, d, lado derecho).

En ocho pares de células que se encontraban en etapas posteriores de exocitosis, observamos grandes vesículas membranosas colocadas entre las válvulas recientemente exocitosadas de dos células hijas y sus bandas de cintura (Fig. 4e). En los tres pares restantes de células con válvulas exocitosisadas recientemente, no observamos vesículas ni restos de membrana entre las dos células hijas. Sin embargo, en esas tres células, las bandas de cintura parentales no encerraban a las células hijas, lo que apunta a una etapa posterior del ciclo celular, en la que se degradaron todos los desechos extracelulares. En particular, ninguna de las células de las que se tomaron imágenes contenía vesículas endocíticas en ciernes o una señal de formación de una nueva membrana debajo de la válvula. Por lo tanto, los datos de cryo-ET sugieren que T. pseudonana usa el mismo mecanismo de exocitosis que inferimos de los datos recopilados para S. turris, donde la membrana SDV proximal se reutiliza como una nueva membrana plasmática y las membranas distales se desintegran extracelularmente (Fig. 4f).

La extrusión de las paredes celulares rígidas de las diatomeas es un evento de exocitosis excepcional, difícil de reconciliar con los mecanismos de exocitosis conocidos. Nuestras observaciones, de parches de membrana desprendidos en el espacio extracelular de dos especies de diatomeas adquiridas con tres técnicas de microscopía, son incompatibles con los mecanismos clásicos de exocitosis. Las características estructurales de estas membranas sueltas y desconectadas después de la formación de la válvula contrastan marcadamente con la ultraestructura de SDV durante el crecimiento de sílice, que forma un espacio altamente confinado que es fundamental para controlar la forma de las estructuras de sílice en crecimiento35,36,37. Por lo tanto, sugerimos que la exocitosis de las válvulas maduras ocurre a través de un mecanismo único en el que la membrana plasmática vieja y la membrana SDV distal se descartan en el espacio extracelular y la membrana SDV proximal asume el papel de una nueva membrana plasmática (Figs. 4f, S2) . Este escenario está de acuerdo con observaciones previas de intercambio rápido de proteínas SDV con la membrana plasmática en estudios de células vivas de T. pseudonana2,38.

Este escenario también está respaldado por el hecho de que ninguna de las células en nuestros conjuntos de datos muestra signos de procesamiento o reciclaje de las membranas SDV, o la formación de una nueva membrana plasmática debajo de la válvula. Sin embargo, somos conscientes de que nuestras imágenes de células vivas podrían no tener la resolución espacial para detectar tales eventos, y que la microscopía electrónica solo brinda información sobre instantáneas aleatorias en el tiempo y el espacio. Por estas razones, realizamos un análisis estadístico para determinar la probabilidad de que la exocitosis implique el reciclaje endocítico de la membrana SDV. El escenario probado fue que las invaginaciones de ~ 1 μm observadas en S. turris son en realidad parte de dicho proceso de recuperación endocítica (Fig. S8). Si este es el caso, requerirá el reciclaje de ~1300 tales invaginaciones. Ejecutamos una simulación estadística (consulte la sección Información de apoyo), asumiendo una ventana de tiempo de 10 a 20 s para que se desarrolle una invaginación y sea visible en una imagen, y un total de 30 minutos para la exocitosis de la válvula. La simulación también aborda la probabilidad de 'atrapar' este evento en una fina porción aleatoria de TEM. Ejecutar la simulación 10 000 veces usando las condiciones permisivas de 10 s para una invaginación mostró que tales invaginaciones deberían detectarse en promedio 15 veces de 68 observaciones (correspondientes a las 68 observaciones reales, Fig. 3). Además, en más del 99,9% de los casos, el escenario simulado incluyó la detección de más de 7 eventos de este tipo cuando se realizaron 68 observaciones (correspondientes a los 7 casos observados, Fig. S8). Por tanto, podemos descartar la opción de internalización de estas membranas mediante endocitosis compensatoria con una probabilidad de p < 0,001, según el test de permutación.

El escenario propuesto sugiere que tras la exocitosis, la membrana SDV proximal se convierte en la nueva membrana plasmática. Como cada una de las membranas SDV y plasmáticas lleva a cabo tareas diferentes y especializadas, es probable que ambas requieran composiciones únicas de lípidos y proteínas, que deberían ajustarse después de la fusión. De hecho, se ha demostrado que las células de T. pseudonana con SDV tienen una composición lipídica ligeramente alterada, en comparación con las células que no contienen SDV, y se ha demostrado que varias proteínas están asociadas específicamente con la membrana SDV2,39,40,41. Las posibles alteraciones en la membrana SDV proximal para restaurar la composición lipídica específica de la membrana plasmática pueden estar mediadas por las llamadas proteínas de transferencia de lípidos, transportadores de lípidos que transfieren lípidos específicos entre las membranas donadora y aceptora42. El hallazgo de que las membranas distales se desintegran extracelularmente es sorprendente, ya que parece un desperdicio desechar una cantidad tan grande de membranas en cada ciclo celular. La baja afinidad de FM4-64 por los desechos degradantes impide la capacidad de seguir el destino de estas membranas32. Sin embargo, es importante tener en cuenta que las bandas de cintura forman un compartimento casi cerrado alrededor de las válvulas recién formadas, lo que posiblemente ralentiza la difusión fuera de la célula y facilita la absorción de los restos de membrana para uso celular después de la desintegración. Posiblemente, esto puede minimizar los costos energéticos de tal proceso.

La exocitosis de gran contenido también se investigó en otros organismos, demostrando mecanismos que difieren de la vía secretora clásica de numerosas vesículas pequeñas que se fusionan con la membrana43. Una alternativa es la exocitosis de vesículas gigantes en las glándulas salivales de Drosophila que exprimen su carga viscosa a través de un poro al arrugar la membrana vesicular, seguido por el reciclaje de la membrana44. Otra alternativa, la reacción del acrosoma, sorprendentemente comparte similitudes con nuestra propuesta para la exocitosis de la válvula de diatomeas. En este proceso, la membrana plasmática y la membrana acrosomal distal se fusionan en varios lugares formando vesículas que se dispersan en el ambiente mientras que la membrana acrosomal proximal permanece intacta y se convierte en el nuevo límite que separa los espermatozoides del ambiente45,46.

Para concluir, este trabajo propone un mecanismo único para la exocitosis de sílice de diatomeas, que involucra dos eventos notables. Primero, la reutilización de una membrana de orgánulo en una membrana plasmática y segundo, la desintegración a gran escala de las membranas. Este mecanismo es compartido por dos especies de diatomeas modelo, lo que indica que este podría ser un mecanismo general. Con la caja de herramientas para la investigación genética en el cultivo de diatomeas, pronto será posible investigar la maquinaria proteica que está involucrada en la regulación de este evento y su relación con la exocitosis clásica.

S. turris fue aislado del Mar del Norte en 2004 y proporcionado por el grupo del Prof. Eike Brunner, TU Dresden. Los cultivos de diatomeas se mantuvieron en agua de mar mediterránea natural que se filtró, se corrigió su salinidad al 3,5% y se complementó con una receta de nutrientes f/2 (Sigma Aldrich), y para Thalassiosira pseudonana (CCMP1335) se complementó con ácido silícico 330 µM (Sigma Aldrich). Los cultivos se mantuvieron a 18 °C en ciclos de luz/oscuridad de 16/8 h.

Para la sincronización del ciclo celular, se usaron 5 ml de un cultivo de células maduras de S. turris para iniciar un nuevo cultivo de 50 ml. Después de 48 h de crecimiento bajo el ciclo normal de 16 L/8 D, el cultivo se colocó en oscuridad durante 20 h. Después de 20 h de oscuridad, el cultivo se expuso nuevamente a la luz. La sincronización de T. pseudonana se realizó mediante inanición de Si, como se describió anteriormente7. Para mantener el cultivo en una fase de crecimiento exponencial, se cultivaron en ciclos de luz/oscuridad de 12/12 h y se diluyeron (1:10) en medio fresco cada dos días durante la semana anterior a la sincronización del cultivo. Para inducir la inanición de Si, se centrifugaron alícuotas de 100 ml de cultivo a 3000 × g durante 10 min y se volvieron a suspender en agua de mar artificial libre de Si o agua de mar filtrada; este paso se repitió tres veces. A continuación, los cultivos (~0,5 millones de células/ml) se mantuvieron en la oscuridad durante 12 h con agitación en un medio libre de Si para detener el ciclo celular. Luego, los cultivos se transfirieron a luz continua durante 4 h adicionales de privación de Si. Al final del período de inanición de Si, las células se concentraron hasta aproximadamente 10 millones de células/ml y se repuso Si hasta 330 µM. Para rastrear la formación de nueva sílice, se agregó PDMPO [2-(4-piridil)-5-((4-(2-dimetilaminoetil-amino-carbamoil)metoxi)-fenil)oxazol] (ThermoFisher Scientific, EE. UU.). La fluorescencia de PDMPO se controló mediante imágenes de los cultivos con un microscopio de epifluorescencia (Nikon Eclipse Ni-U, ex: 365 em: 525). La mayor cantidad de células de S. turris y T. pseudonana en división se contaron después de 9 y 3 h, respectivamente.

Las células se prepararon para SEM usando secado en punto crítico (CPD). Las células se fijaron en una solución de glutaraldehído al 2 % y paraformaldehído al 4 % en agua de mar artificial durante 1 hora a temperatura ambiente mientras se agitaba. Después de tres lavados con agua desionizada (Milli-Q® IQ 7003 Ultrapure Lab Water System, Merck), las células se deshidrataron lavándolas en una serie graduada de etanol. El lavado final se realizó en etanol anhidro al 100 % durante la noche. A continuación, las muestras deshidratadas se secaron en un secador de punto crítico utilizando CO2 líquido como fluido de transición. Las células secas se colocaron sobre una cinta de carbono conductora sobre un trozo de aluminio.

Las muestras se recubrieron por pulverización con iridio de 2,5 nm (T. pseudonana) o 4 nm (S. turris) (Safematic) y se tomaron imágenes con un microscopio electrónico de barrido Ultra 55 FEG (Zeiss, Alemania), utilizando 3–5 kV, tamaño de apertura 20 –30 μm y una distancia de trabajo de unos 3 mm.

Para las imágenes de lapso de tiempo de una sola célula, se sincronizó un cultivo y se tiñó con PDMPO (330 µM). Aproximadamente 8 h después del final de la inanición de luz, cuando la mayoría de las células habían pasado por la citocinesis, se tomó una alícuota de 100 µl y se añadió FM4-64 (ThermoFisher Scientific, EE. UU.) a una concentración final de 4–8 µM para teñir las membranas. . Después de agregar el colorante de la membrana, se montó una gota de 20 µl en un portaobjetos de microscopio y se cubrió con un cubreobjetos de vidrio, usando cera dental como espaciador. Las muestras se visualizaron utilizando un microscopio confocal Leica TCS SP8-STED equipado con un objetivo HCS PL APO 86×/1,20 W motCORR. FM4-64 y la autofluorescencia de clorofila se adquirieron mediante láser de luz blanca utilizando una línea láser de 550 nm (6% de potencia láser) y una línea láser de 650 nm (7% de potencia láser), respectivamente. La fluorescencia de PDMPO se adquirió usando un láser de 405 nm (5% de potencia de láser). Se usaron detectores HyD-SMD para PDMPO y FM4-64 con un ancho de recolección de emisiones establecido en 474–530 y 608–640 nm, respectivamente. La emisión de autofluorescencia de clorofila se recolectó utilizando un detector HyD con un ancho de detección de 741–779 nm y el canal de transmisión se detectó con un detector PMT. Se tomaron imágenes de las células durante 2 a 4 h a intervalos de 3 a 60 min. Las imágenes se analizaron utilizando Leica Application Suite X v3.5.7. En total, se recopilaron lapsos de tiempo de más de 50 celdas durante todo el período.

Las células de S. turris se criofijaron mediante congelación a alta presión (HPF), seguida de sustitución por congelación (FS), de acuerdo con los protocolos publicados previamente29,47. Las células sincronizadas se recogieron en una membrana de filtro de 5 µm y se transfirieron a un tubo Eppendorf utilizando 200 µl de agua de mar. Después de dejar sedimentar las células durante 10 minutos, se pipetearon alícuotas de 2 µl en discos de aluminio (Wohlwend GmbH, Sennwald, Suiza) y se cargaron directamente en una máquina de congelación de alta presión Leica ICE (Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Alemania). Las muestras concentradas de diatomeas se vitrificaron en nitrógeno líquido (-192 °C) a 210 MPa (2048 bar). Las muestras vitrificadas se almacenaron en nitrógeno líquido hasta la sustitución por congelación en un EM ASF2 (Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Alemania). El agua vitrificada se sustituyó por un disolvente orgánico, acetona anhidra al 100 %, a (-90 °C). Luego, se complementó la acetona con fijadores químicos (acetato de uranilo al 0,2 % y tetróxido de osmio al 0,2 %) para mejorar la reticulación y el contraste de las estructuras celulares. Las muestras se sumergieron en la solución durante 48 h a -90 °C y luego se dejaron calentar gradualmente durante 24 h a -20 °C, y luego en una hora a 0 °C. Después de tres lavados en acetona, la acetona se reemplazó con Epon (Agar Scientific Ltd, Stansted, Reino Unido) usando mezclas de concentración en gradiente (10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 60 %, 80 %, 100 % Epon en acetona) , dos veces al día a temperatura ambiente. La muestra en 100% Epon se endureció a 70 °C durante 72 h. Se cortaron secciones ultrafinas de 70 nm utilizando un ultramicrótomo (Ultracut UCT, Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Alemania) equipado con un cuchillo de diamante (Ultra 45°, Diatome Ltd, Nidau, Suiza). Las secciones se recogieron en rejillas TEM de cobre, recubiertas con una película de carbono. Luego, las secciones se tiñeron posteriormente colocándolas en una gota de solución de citrato de plomo. Después de tres minutos de tinción, las rejillas se lavaron tres veces con gotas de agua y luego se secaron con papel de filtro Whatman. En total, preparamos 16 muestras congeladas que luego se procesaron mediante sustitución por congelación durante tres ciclos diferentes y, posteriormente, se tomaron imágenes de cientos de células.

Se tomaron imágenes de las muestras de TEM con un TEM Tecnai Spirit (FEI, Eindhoven, Países Bajos) operado a 120 kV y equipado con una cámara Gatan Oneview 4 k × 4 k (Gatan Inc., Pleasanton, EE. UU.).

Las células sincronizadas de T. pseudonana se vitrificaron mediante congelación por inmersión en rejillas de película de carbón perforado R2/1 de cobre de malla 200 descargadas luminiscentes (Quantifoil Micro Tools GmbH, Grossloebichau, Alemania). En un Leica EM GP (Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Alemania), se pipeteó 1 µl de agua de mar artificial en el lado de cobre para mejorar el flujo de medios al papel secante y 4 µl de suspensión celular a 7–13 × 106 células/ ml se pipeteó en el lado del carbón. Las rejillas se secaron durante 6 segundos desde el lado posterior de la rejilla antes de sumergirlas en un baño de etano líquido enfriado con nitrógeno líquido.

Las células vitrificadas se trituraron en láminas delgadas con el microscopio de doble haz Zeiss Crossbeam 550 FIB/SEM (Zeiss, Alemania). Las rejillas se recubrieron con platino organometálico mediante un sistema de inyección de gas in situ. Las laminillas se fresaron con una inclinación de 12° con respecto al plano de la rejilla con un fresado basto (hasta un espesor de 1 µm) que implicaba dos pasos utilizando el haz de iones de galio a 30 kV y una corriente de 300 pA y 100 pA. Después de un desbaste de todas las láminas, se diluyeron a 200 nm con una corriente de 50 pA.

Los datos de tomografía crioelectrónica se recogieron de 59 pares de células. Las series de inclinación se adquirieron utilizando un TEM Titan Krios G3i (Thermo-Fisher Scientific, Eindhoven, Países Bajos), que opera a 300 kV. Las series de inclinación se registraron en un detector directo K3 (Gatan Inc., Pleasanton, EE. UU.) instalado detrás de un filtro de energía BioQuantum (Gatan Inc., Pleasanton, EE. UU.), utilizando una rendija de 20 eV. Todas las series de inclinación se registraron en modo de conteo con un aumento nominal de 33.000x, correspondiente a un tamaño de píxel físico de 0,26 nm, utilizando el esquema de dosis simétrica a partir de la inclinación previa de la lamela de −12° y con incrementos de 2°48. Las series de inclinación que aparecen en la Fig. 4a, c se tomaron con un desenfoque de 3 µm y se insertó una placa de fase Volta. El rango de la serie de inclinación estuvo entre -60° y 50°. La serie de inclinación que aparece en la Fig. 4e se tomó con un desenfoque de 7 μm, se insertó una apertura de objetivo de 100 μm y un rango de inclinación de -66 ° a 48 °. Las series de inclinación se adquirieron utilizando un procedimiento de dosis baja automatizado implementado en SerialEM v3.8 con una dosis total establecida en ~100e-/Å2 49. Los tomogramas se reconstruyeron utilizando el software IMOD v. 4.9.1250. Para la segmentación se utilizó el software Amira v2021.2 (Thermo-Fisher Scientific, Eindhoven, Países Bajos). Las membranas se segmentaron utilizando el módulo de filtro de mejora de membrana y el refinamiento manual51.

Nuestros datos indican que las diatomeas utilizan un mecanismo sorprendente y no canónico para exocitar sus válvulas de sílice. Para considerar un escenario alternativo, en el que las diatomeas usan un mecanismo canónico conocido de exocitosis de válvula, realizamos una simulación estadística que informará si tal escenario es probable. En la exocitosis canónica, la membrana de la vesícula secretora se fusiona por completo con la membrana plasmática y la homeostasis de la membrana se mantiene equilibrando la membrana añadida mediante endocitosis compensatoria. En el supuesto escenario que queremos investigar, la membrana SDV se recicla mediante endocitosis compensatoria de vesículas de tamaño constante. Para simular tal escenario, tuvimos que estimar cuántas vesículas deben someterse a endocitosis para volver a internalizar la membrana SDV tras la exocitosis de la válvula y cuántas de esas vesículas deberían haber aparecido en nuestro conjunto de datos.

A partir de las propiedades geométricas básicas de la célula de diatomeas, el área de superficie de las membranas SDV proximales y distales (excluyendo las membranas alrededor de las extensiones de enlace) ≈ área de superficie de toda la célula que se puede simplificar en una cápsula (Fig. S9). Por lo tanto, calculamos el área de tal cápsula:

Una cápsula es un cilindro con hemisferios en cada extremo. El área superficial de una cápsula se define como la suma del área superficial del cilindro en el centro y el área superficial combinada de los dos hemisferios. Para calcular el área de la superficie de la cápsula se necesita el radio (r) de los hemisferios y la longitud del cilindro central (a). Las células de S. turris tienen un diámetro de 20 a 25 μm, por lo que en el cálculo elegimos un radio de 11 μm. La longitud del cilindro (a) es igual a la longitud total de la celda menos los radios de los dos hemisferios (60 μm–11 μm–11 μm = 38 μm). Por lo tanto, el área de superficie (SA) de la cápsula (y la membrana SDV) es:

En nuestros datos TEM de S. turris, observamos invaginaciones de membrana con diámetros que oscilan entre 0,5 y 1 μm. El área de superficie de tales invaginaciones se puede calcular aproximando su geometría a la de una esfera: \({{{{{{\rm{SA}}}}}}}_{{{{{{\rm{esfera} }}}}}}=4\pi{r}^{2}\)

De los cálculos anteriores se deduce que el número de vesículas endocíticas necesarias para reciclar toda la membrana SDV es:

Los estudios de endocitosis resuelta en el tiempo indican que un solo evento de endocitosis de una vesícula con un diámetro de 1 μm debería tomar al menos 10 s49,50,51,52,53,54,55.

Basándonos en nuestros datos, suponemos que el proceso de reciclaje debería terminar en 30 min.

Además de los factores temporales en las secciones 4 y 5 que influyen en las posibilidades de observar una vesícula endocítica, existe un factor espacial que es la posibilidad de detectar dicha vesícula en un corte aleatorio de TEM. Dado que las células tienen forma de cápsula y se encuentran aproximadamente horizontalmente en las muestras incrustadas, podemos estimar la probabilidad espacial de detectar una vesícula con un diámetro x en un corte aleatorio que atraviesa la sección transversal redonda de una célula con un diámetro y como (Fig. S9 ): \(\tfrac{x}{y}\) = \(\tfrac{1}{22}\) para una vesícula de 1 μm en una sección TEM de una célula de S. turris de 22 μm.

Dados los cuatro parámetros identificados en las secciones anteriores, construimos un escenario simulado (usando R, v. 4.1.2) en el que hay 1274 eventos (vesícula endocítica) que duran 10 segundos dentro de un marco de tiempo de 30 min, y la simulación es elegir instantáneas aleatorias (cortes TEM) en las que la posibilidad de visualizar un evento (si es que realmente ocurre) es de 0,045 (1/22). Dado que nuestro conjunto de datos TEM incluye siete posibles vesículas endocíticas en las 68 células de S. turris que estaban experimentando exocitosis, simulamos cuáles son las posibilidades de que se observen siete eventos de este tipo dadas 68 observaciones. La simulación muestra que en >99,5% de los casos se deben detectar más de siete eventos endocíticos (Fig. S10A).

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Todos los datos relevantes que respaldan los hallazgos clave de este estudio están disponibles en el artículo y sus archivos de información complementaria o del autor correspondiente a pedido razonable. Los datos de origen se proporcionan con este documento y en Dryad, https://doi.org/10.5061/dryad.gxd2547n3. Los datos de origen se proporcionan con este documento.

El código utilizado en este estudio está disponible a través del siguiente enlace: https://zenodo.org/record/7339127#.Y58SgXZBwuU.

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Descargar referencias

Agradecemos a Anne Jantschke, Nathalie Pytlik y Eike Brunner de TU Dresden por proporcionar cultivos. Agradecemos a Simon Michaeli del Instituto Volcani (ARO) por su contribución en la búsqueda de la plataforma de imágenes de células vivas adecuada. Este proyecto ha recibido financiación del Consejo Europeo de Investigación (ERC) en el marco del programa de investigación e innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea (acuerdo de subvención n.º 848339). Las imágenes de células vivas se realizaron en el Observatorio de células cancerosas de Picciotto en memoria de Wolfgang y Ruth Lesser. El trabajo fue apoyado por el Irving and Cherna Moskowitz Center for Nano and Bio-Nano Imaging en el Weizmann Institute of Science D.dH. fue apoyado por la Iniciativa de Investigación de Sostenibilidad y Energía (SAERI) del Instituto de Ciencias Weizmann.

Departamento de Ciencias Vegetales y Ambientales, Instituto de Ciencias Weizmann, Rehovot, Israel

Muerte de Haan, Lior Aram, Hadas Peled-Zehavi, Oz Ben-Joseph y Assaf Gal

Instalaciones básicas de ciencias de la vida, Instituto de Ciencias Weizmann, Rehovot, Israel

Yoseph Addadi y Ron Rotkopf

Departamento de Apoyo a la Investigación Química, Instituto de Ciencias Weizmann, Rehovot, Israel

nadav elad y katya rechav

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D.dH., realizó experimentos, analizó datos, redactó y editó el manuscrito. LA realizó experimentos cryoET y análisis de datos. HPZ realizó experimentos de microscopía confocal. YA contribuido al diseño experimental de los experimentos de microscopía confocal. OB ayudó con la preparación de muestras TEM a temperatura ambiente. RR realizó los análisis estadísticos. NE contribuido a los experimentos cryoET y análisis de datos. KR ayudó con la preparación de laminillas FIB. AG proporcionó supervisión, adquisición de fondos y borradores revisados.

Correspondencia a Assaf Gal.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a Kimberlee Thamatrakoln y a los otros revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de los revisores están disponibles.

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de Haan, D., Aram, L., Peled-Zehavi, H. et al. La exocitosis de la pared celular silicificada de las diatomeas implica una extensa desintegración de la membrana. Nat Comun 14, 480 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-36112-z

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Recibido: 04 Agosto 2021

Aceptado: 16 enero 2023

Publicado: 30 enero 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-36112-z

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